亜鉛フィンガータンパク質の細胞内活性酸素種に対するセンサー分子としての機能解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26350962
• Research Institution: Doshisha Women's College of Liberal Arts
• Principal Investigator: 根木 滋 同志社女子大学, 薬学部, 助教 (50378866)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 亜鉛フィンガー / レドックス / 酸化 / 転写因子 / 過酸化水素 / レドックスレンサー

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、ヒト転写因子のDNA結合ドメインであるSp1亜鉛フィンガータンパク質とH2O2との酸化反応についてより詳細に検討を行った。これまでの検討から、酸化反応後の生成物の質量をMALDI-TOFマスにより測定すると、Sp1-F1では還元体から2マス減少するが、Sp1-F2,F3では14マス増加することが分かっている。14マス増加の理由は、以前の報告例を参考にすると、Sp1-F2,F3ではジスルフィドの他に、さらにその部分が酸化されてS-S=O酸化体が生成していると予想された。
そこで、S-S=O酸化体をTCEPで再還元してマス測定を行うと、分子量が還元体と比較して16マス増加することが分かった。この結果から、O原子がペプチドに1つ付加していることが考えられ、S-S=O酸化体の構造ではこの現象の説明がつかないことが分かった。そこで、Cys残基をAla残基に置換した変異体を作製し酸化反応を行ったところ、SH基がなくても16マス増加が認められ、他のアミノ酸が酸化を受けていることが明らかとなった。
Sp1-F2,F3の配列を見てみると配列中にMet残基があり、一般的には酸化反応を受けやすいアミノ酸残基として知られている。そこで、このMet残基をAlaに置換した変異体を作製し酸化反応を行うと、反応生成物が還元体より2マス減少したことから、Met残基がCysのSH基と同時に酸化されてS=Oが形成されていることが明らかとなった。次に、Sp1-F2,F3の各フィンガードメインの酸化体を再還元して得られるO付加体の構造をCDスペクトルにより検討を行ったところ、いずれの場合もMet残基にO原子が付加していても、CysのSH基が回復することによりZn(II)と結合し、二次構造を形成することが明らかとなった。また、金属置換体フィンガーの酸化についても検討い、金属イオンの重要性を明らかにしている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Ｓｐ１亜鉛フィンガーを用いて過酸化水素との反応性について詳細に検討を行った。これまでの報告例を一部異なる結果が得られたために、その理由を探索するのにやや時間がかかったが、その理由を明確にすることができた。また、構造解析についてもＣＤ，ＮＭＲの検討を開始している。よって、ほぼ当初の計画通りに研究が進んでいると判断する。

Strategy for Future Research Activity

概ね研究計画は順調に進行していると考えられる。最終年度は残りの細胞内でのレドックスに関する研究計画を実行することともに、現在得られているデータをブラッシュアップし、学会、論文に発表することを目標とする。

Research Products

• [Journal Article] Intrinsic cell permeability of the GAGA zinc finger protein into HeLa (2015)
  • Author(s): Shigeru Neg*i, Yuka terada, Misato Suzuyama, Makoto Matsumoto, Akino Honbo, Yoko Amagase, Yumiko Mizukawa, Akiko Kiriyama, Kastumi Iga, Tetsuro Urushidani, Yukio Sugiura
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 464 Pages: 1034-1039
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.07.060
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Efficient cleavage of DNA oligonucleotides by a non-FokI-type zinc (2015)
  • Author(s): Shigeru Negi*, Michiko Yoshioka, Hiroko Mima, Makoto Mastumoto, Michiko Suzuki, Mao Yokoyama, Koji Kano, Yukio Sugiura,
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter Volume: 25 Pages: 4074-4077
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2015.08.045.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research