2015 Fiscal Year Research-status Report
真菌における分生子形成誘導ジテルペノイドの生合成解析と受容体探索
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26350965
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
兼目 裕充 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (10399438)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ジテルペン / 環化酵素 / 真菌 / 分生子 / 阻害剤 / ドッキングシミュレーション / Penicillium / Aspergillus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真菌類の生活環の多くを占める無性世代において，分生(胞)子形成は伝播・拡散を行うための重要な手段であるが、その誘導メカニズムは不明な点が多く，統一的な理解には未だ至っていない，我々はこれまでに，<i>Penicillium cyclopium</i>シノニム6種および<i>Aspergillus nidulans</i>が持つ新規ジテルペン酵素オーソログ／パラログのPeDSおよびAnDS1について機能解析を行い，それぞれの酵素が環化する新規ジテルペノイド類が極微量で分生(胞)子形成の誘導と菌糸の増殖生長を抑制することを見出した。本研究の目的は，これらの新規ジテルペノイド類と分生(胞)子形成誘導の解明するために，PeDSおよびAnDS1によるジテルペン環化メカニズムを基盤とする酵素阻害剤の探索・創生，および活性本体までの代謝を担う環化酵素以降の生合成酵素類と活性本体の受容体を明らかにすることである。
本年度は以下の実験を行い結果を得ることができた。1）前年度までにPeDSおよびAnDS1立体構造モデルと化合物構造ライブラリーのバーチャルスクリーニングで得られた阻害剤候補について、それぞれのリコンビナント酵素を用いた酵素阻害実験および固形培地上でのペーパーディスク法による分生(胞)子形成誘導阻害実験を行った。選択したほとんどの阻害剤候補は酵素阻害および分生(胞)子柄形成阻害を示した。中でも2uMでAnDS1酵素活性をほぼ完全に阻害した阻害剤は，固形培地上0.25umol/discの濃度で<i>A. nidulans</i>の分生胞子柄形成を半分以下に抑えることが明らかとなった。2）容活性本体までの代謝を担う環化酵素以降の生合成酵素類と活性本体の受容体を明らかにする目的で、PeDSおよびAnDS1のノックアウト（KO）体の作出を試みた。現在、これらのKO体候補の評価を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
活性本体までの代謝を担う環化酵素以降の生合成酵素類を明らかにする目的で<i>P. cyclopium</i>シノニムにおいては，ゲノム上でPeDS遺伝子近傍に存在するP450酵素遺伝子と<i>A. nidulans</i>においてはこれと相同性の高いP450酵素遺伝子を酵母の発現系を用いて機能解析を行ったが、両菌における環化酵素産物の酸化反応は確認できなかった。このことから，これらのP450酵素遺伝子のノックアウトによる機能解析に切り替えるべく、<i>P. cyclopium</i>シノニムおよび<i>A. nidulans</i>におけるPeDS遺伝子およびAnDS1遺伝子のノックアウト（KO）体の作出を試みた。現在、これらのKO体候補の評価を行っており、得られた時点でそれぞれのP450酵素遺伝子とのダブルKO体を作出して、機能解析を行う予定である。
一方，<i>A. nidulans</i>におけるAnDS1環化産物の酸化体と思われる分生(胞)子誘導活性本体は未だ明らかになっていないことから、AnDS1環化産物の<i>A. nidulans</i>による代謝変換を行い，代謝産物を得ることに成功した。現在，構造解析を行うべく、量的供給と精製を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
活性本体までの代謝を担う環化酵素以降の生合成酵素類を明らかにする目的で、<i>P. cyclopium</i>シノニムおよび<i>A. nidulans</i>におけるPeDS遺伝子およびAnDS1遺伝子のノックアウト（KO）体の作出を試みた。現在、これらのKO体候補の評価を行っており、得られた時点でそれぞれのP450酵素遺伝子とのダブルKO体を作出して、機能解析を行う予定である。また，PeDS遺伝子およびAnDS1遺伝子のKO体は、分生(胞)子誘導活性本体の受容体を明らかにする目的でも使用できることから、KO体を得られた時点で，候補受容体タンパクをコードする遺伝子とのダブルKO体を作出して、受容体を明らかにする予定である。
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