• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2015 Fiscal Year Research-status Report

生体分子間相互作用を網羅する新型1分子蛍光イメージング法の開発

Research Project

Project/Area Number 26390035
Research InstitutionWaseda University

Principal Investigator

谷井 孝至  早稲田大学, 理工学術院, 教授 (20339708)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 山本 英明  東北大学, 学内共同利用施設等, 助教 (10552036)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords1分子イメージング / 蛍光観察 / FRET / ZMW
Outline of Annual Research Achievements

ヒトの体内で重要な働きをするタンパク質の多くは、濃度を~μMにまで高めないと、効果的にリガンドと結合して特異的な機能を発現することができない。しかしながら、従来の1分子蛍光イメージング法では、このような高濃度条件下で目的の1分子だけを可視化することは不可能であった。そこで、改良型ゼロモード導波路(ZMW)と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを融合した新しいリアルタイム1分子蛍光イメージングを開発することを目的として以下の実験に取り組んだ。
(1)DNAアプタマを用いたセンサ応用: 光をZMW内部に閉じ込め、さらにFRETを活用することにより、高濃度条件下でZMWに固定したDNAアプタマが標的分子と結合(または解離)することを可視化できる。今回、グアニンカルテットと呼ばれる配列を含むDNAアプタマを設計した。このDNAアプタマは、Caイオンと結合すると折りたたまれる性質を有する。これを活用して、Ca濃度依存的にDNAアプタマが折りたたまれる様子を観察すること試みた。2015年度の設計と実験を通して、ZMW内に固定したDNAアプタマからの1分子蛍光は観察できているものの、設計に問題があることが判明したので、再設計を試みている。
(2)インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼのDNA切断過程のリアルタイム1分子蛍光イメージング: インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼがDNAに結合する過程、DNAを切断する過程、およびDNAから解離する過程を1分子でリアルタイムに蛍光観察する系の構築に着手した。PANにはGFP蛍光タンパク質が修飾され、PANがZMWに固定されたDNAに結合・解離する瞬間も同時に捕捉することができる。2015年度には、静的な実験ではあるものの、濃度1μMのPAN-GFPがZMWに固定したDNAを切断することが確認でき、リアルタイム観察に向けた前準備が整いつつある。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当研究グループは、半導体微細加工を活用してZMWを自作し、その構造を自在に改良することができる。ZMWを活用した1分子蛍光イメージングを研究している他の研究グループからの報告では、ZMWを用いると、ZMW内部に固定した分子のFRET効率が低下することが問題となっていた。FRETは近距離相互作用であるので、ZMWとFRETのとが融合できるようになれば、より高濃度で1分子蛍光イメージングを実行でき、観察できるタンパク質の種類や観察できる機能を拡張できる。
2014年度に行った、モレキュラービーコンを用いたデモンストレーションでは、ZMWの構造を改良することによって、ZMW内でも十分なFRET効率を確保できることを見出した。これにより、2015年度には、DNAアプタマ(グアニンカルテット)を用いたCaイオンセンサへの応用やインフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼ(PAN)のDNA切断素過程の1分子イメージングといった新しい実験へと展開することが可能となった。エンドヌクレアーゼの活性を高めるために、当初計画になかったサンプルステージの温度調整が必要となったが、これを自作することで完成し、なおかつ70℃まで高温にしても1分子FRETが計測できることを確認した。
一方、DNAアプタマの設計に問題があることが判明したが、この取り組みは当初の計画で最終段階に位置付けられているので、当初予想していなかった問題が早い段階で明らかとなり、設計変更によって回避できると考えられるので、おおむね順調に進展している、と考えている。

Strategy for Future Research Activity

(1)DNAアプタマを用いたセンサ応用: 課題は、DNAアプタマをZMWに固定する化学官能基と、FRETを生じさせるためのドナー/アクセプタ蛍光分子とを、グアニンカルテットによるDNAアプタマの折りたたみを阻害しないように、DNA配列に組み込むことである。
設計した上記2種類のDNAアプタマを用いた実験では、Ca依存的な折りたたみ、すなわちCa濃度に依存したFRET効率の変化は観測されなかった。現在、この原因について継続的に調査中であるが、おそらくFRET効率を調節するためにDNA配列設計時に挿入したアデニンとチミンからなるスペーサが、グアニンカルテットの形成を阻害し、Caイオンとの結合力を低下させてしまったと考えている。2016年度にはDNA配列を再設計して実験を進める。
(2)インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼのDNA切断過程のリアルタイム1分子蛍光イメージング: 2015年度には、静的な実験ではあるものの、濃度1μMのPAN-GFPがZMWに固定したDNAを切断することが確認できた。現在、①PANとDNAとの結合、②DNAの切断、および③PANの解離を時間軸上で同時に捕捉できるよう光学系を改良している。①から③の観測を成功させ、DNA切断過程の解析を実行する。
(1)および(2)の成功をもって、2016年度(最終年度)に、改良型ゼロモード導波路(ZMW)と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを融合した新しいリアルタイム1分子蛍光イメージングの開発を完遂したい。

  • Research Products

    (16 results)

All 2016 2015 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 2 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Invited: 1 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)(Italy)

    • Country Name
      Italy
    • Counterpart Institution
      Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)
  • [Int'l Joint Research] Ulm University/The University of Stuttgart/Maxplanck Institute(Germany)

    • Country Name
      Germany
    • Counterpart Institution
      Ulm University/The University of Stuttgart/Maxplanck Institute
  • [Journal Article] Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution Using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons2015

    • Author(s)
      K.Sekine, H.Yamamoto, S.Kono, T.Ikeda, A.Kuroda, T.Tanii
    • Journal Title

      e-Journal of Surface Science and Nanotechnology

      Volume: 13 Pages: 213-218

    • DOI

      10.1380/ejssnt.2015.213

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment using TiO2 Photocatalysis2015

    • Author(s)
      H.Yamamoto, T.Demura, K.Sekine, S.Kono, M.Niwano, A.Hirano-Iwata, T.Tanii
    • Journal Title

      Journal of Visualized Experiments

      Volume: 104 Pages: e53045

    • DOI

      10.3791/53045

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Neuraminidase-dependent Degradation of Polysialic Acid Is Required for the Lamination of Newly Generated Neurons2015

    • Author(s)
      M.Sajo, H.Sugiyama, H.Yamamoto, T.Tanii, N.Matsuki, Y.Ikegaya, R.Koyama
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 11 Pages: e0146398

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0146398

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] レーザ走査光触媒リソグラフィを活用した液中細胞パターニング2016

    • Author(s)
      藤城翔偉、関根浩平、河野翔、池田丈、黒田章夫、山本英明、谷井孝至
    • Organizer
      第63回応用物理学会春季学術講演会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2016-03-21
  • [Presentation] マイクロパターン表面を用いた培養神経回路の構造-機能制御2016

    • Author(s)
      山本英明,石原広識,河野翔,千田雄大,松村亮佑,平野愛弓,久保田繁,谷井孝至,庭野道夫
    • Organizer
      第63回応用物理学会春季学術講演会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2016-03-19
  • [Presentation] Spontaneous activity patterns of small neuronal ensemble2016

    • Author(s)
      H.Yamamoto, A.Hirano-Iwata, T.Tanii, S.Kubota, M.Niwano
    • Organizer
      The 4th RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer
    • Place of Presentation
      Miyagi
    • Year and Date
      2016-02-23
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Live-cell identification of excitatory-inhibitory cell types of cultured cortical neurons focusing on specific axon growth length on micropatterns2016

    • Author(s)
      S.Kono, T.Kushida, H.Yamamoto, T.Tanii
    • Organizer
      The 4th RIEC International Symposium on Brain Functions and Brain Computer
    • Place of Presentation
      Miyagi
    • Year and Date
      2016-02-23
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 表面マイクロ改質技術を活用した培養神経細胞/回路の構造制御2015

    • Author(s)
      山本英明、平野愛弓、谷井孝至、庭野道夫
    • Organizer
      第35回表面科学学術講演会
    • Place of Presentation
      茨城
    • Year and Date
      2015-12-01
  • [Presentation] Laser-Scanning Photocatalytic Lithography of Organosilane Monolayers for Fabrication of Artificial Neuronal Circuits2015

    • Author(s)
      K.Sekine, H.Yamamoto, S.Kono, S.Fujishiro, T.Ikeda, A.Kuroda, T.Tanii
    • Organizer
      28th International Microprocesses and Nanotechnology Conference
    • Place of Presentation
      Toyama
    • Year and Date
      2015-11-13
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Manipulating Neuronal Cells in situ by TiO2-Assisted Photocatalytic Lithography2015

    • Author(s)
      H.Yamamoto, A.Hirano-Iwata, T.Tanii, M.Niwano
    • Organizer
      9th International Symposium on Nanomedicine
    • Place of Presentation
      Mie
    • Year and Date
      2015-11-12
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] マイクロパターン上での培養による興奮性-抑制性神経細胞の非標識判別II2015

    • Author(s)
      河野翔, 櫛田昂歳, 山本英明, 谷井孝至
    • Organizer
      第76回応用物理学会秋季学術講演会
    • Place of Presentation
      愛知
    • Year and Date
      2015-09-15
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 培養神経回路の自発発火パターンの素子数依存性に関する理論的考察2015

    • Author(s)
      山本英明,千田雄大,平野愛弓,谷井孝至,久保田 繁,庭野道夫
    • Organizer
      第38回日本神経科学大会
    • Place of Presentation
      兵庫
    • Year and Date
      2015-07-28
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Live-cell, label free identification of excitatory-inhibitory neurons on micropatterned surfaces2015

    • Author(s)
      S.Kono, T.Kushida, H.Yamamoto, T.Tanii
    • Organizer
      Eighth International Conference on Molecular Electronics and Bioelectronics
    • Place of Presentation
      Tokyo
    • Year and Date
      2015-06-22
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous...

    • URL

      http://www.jove.com/video/53045/photopatterning-proteins-cells-aqueous-environment-using-tio2

URL: 

Published: 2017-01-06  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi