2015 Fiscal Year Research-status Report
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26410029
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| Research Institution | Institute for Laser Technology |
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Principal Investigator |
谷口 誠治 公益財団法人レーザー技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (00342725)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 文夫 公益財団法人レーザー技術総合研究所, その他部局等, その他 (20022907)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 分子分光 / 時間分解蛍光 / D-アミノ酸酸化酵素 / 機能阻害効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、薬剤開発の重要な効果の一つである酵素（蛋白質）の機能阻害効果について、時間分解蛍光法を用いて阻害分子の有無による光励起過程の変化を観測し、蛍光消光過程と機能阻害効果の関連や光による反応活性増大過程の詳細等を明らかにすることを目的とする。
昨年度は、様々な脳疾患の要因の一つと考えられているd-アミノ酸酸化酵素（DAAO）の機能阻害効果について検討するため、実際にヒト由来のDAAO（human DAAO）を用い、5種の阻害分子を付加した際のピコ秒蛍光ダイナミクスを計測した。その結果、阻害剤を付加した場合、阻害剤の種類に応じて水溶液中で存在するDAAO単量体、2量体のうち2量体の寿命成分の存在比が低下することがわかった。これは阻害分子が2量体と優先して結合し、錯体を生成するためである。蛍光減衰の前指数因子を用いて阻害剤付加時の錯体生成率を見積もると、3-hydroxy- coumarinを阻害剤に用いた場合に生成率が最も高いことがわかった。またチオフェン環を持つ5,6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-2-carboxylic acidおよび3-thiophen-carboxylic acidを用いた場合にも同様に高い錯体生成率を示した。これらの結果は、時間分解蛍光計測法によりDAAOの錯体生成率が高い精度で得られることを示しており、本手法が阻害薬の開発研究にも有用であるといえる。一方、DAAO単量体の錯体生成率は2量体よりも低下し、阻害剤の種類による選択性も低くなることがわかった。この挙動の違いには、2量体と単量体における蛋白質構造の変化が関与しているものと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、酵素の機能阻害効果について時間分解蛍光法による検討を行うことを目的としており、研究計画では、主としてブタ腎臓由来DAAOを用い、阻害分子の種類によるフェムト秒領域での蛍光過程の差異について検討する予定であったが、最終年度に行う予定であったヒト由来のDAAO試料の準備が整ったため、予定より早く計測を行うことができた。一方で、フェムト秒蛍光計測システムに不具合が生じたこともあり、ブタ腎臓DAAOを用いた研究は予定よりもやや遅れているが、計画全体からみて概ね計画通りの進捗状況であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ブタ腎臓由来DAAOについて、主にアミノ安息香酸類を阻害剤に用いたフェムト秒領域での時間分解蛍光計測による研究を行う。初年度の研究において2-アミノ安息香酸（o-aminobenzoate）を阻害剤に用いた場合について検討を行ったが、置換基（アミノ基、カルボキシル基）の相対配置が異なるm-およびp-aminobenzoateや、クロルプロマジンのような光活性を持つ阻害剤についても検討を行うことにより、DAAOと阻害剤の種類による錯体形成過程や光反応過程の変化についての知見を得る。また、分子動力学および電子軌道計算による水溶液中における蛋白質構造の詳細や電子状態等の見積もりと計測値との相関を明らかとし、蛋白質の機能阻害効果についてより詳細に検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
研究計画では、フェムト秒時間分解蛍光計測システム（アップコンバージョン計測しシステム）の改良を行う予定であったが、現行の蛍光計測システムいくつか不具合（光源レーザーの動作、データ取り込み部）が発生したため、不具合要因や故障箇所の特定等に時間を要したこと、ヒト由来DAAO（human DAAO）の試料の準備が早く整ったため、human DAAOのピコ秒蛍光計測実験を優先して行ったことにより、今年度はシステムの改良を見送った。それに伴い改良に必要な光学部品、電子機器類等の購入を見送ったため、次年度使用額が生じた。また、請求額の一部は投稿論文の掲載費用に使用予定であったが、審査の結果、昨年度中に論文掲載に至らなかったこと、今年度の参加学会が研究所在地の近辺で開催されたことも理由の一つである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は、まず現行のフェムト秒時間分解蛍光計測システムの不具合箇所の修理等を行った後にシステム改良を行うことを予定しており、次年度使用額分は、主に不具合箇所の修理、およびシステム改良に必要な光学部品や電子機器類等の購入に充てる予定である。また次年度請求額分は、主に酵素（DAAO）試料およびその精製や調整に必要な薬品および実験器具、装置類の購入や、論文投稿料、学会参加旅費に充てる予定である。
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