2016 Fiscal Year Annual Research Report
Pattern analysis of post-translational modification using on-line coupling of immunoadsorption and capillary isoelectric focusing.
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26410158
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
志村 清仁 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (30130008)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長井 俊彦 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (90180447)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | キャピラリー等電点電気泳動 / 免疫抽出 / 翻訳後修飾体 / モドフォーム分析 / 分離分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
同一遺伝子に由来する翻訳後修飾産物の存在比パターンは細胞や個体の状態を示す重要な指標となるが、それを知る簡便な方法はない。本研究では、生体試料中の目的タンパク質を抗体マイクロカラムで捕捉し、そのままオンラインでキャピラリー等電点電気泳動によって分離検出する方法の確立を目指した。また、これを微量の生体試料に含まれる特定タンパク質の翻訳後修飾パターンの短時間かつ自動的な分析に応用し、翻訳後修飾に着目した医学生物学研究と新たな疾病マーカーの利用を飛躍的に発展させる画期的な基盤ツールとなることの実証を目指した。
抗体カラムと等電点電気泳動用キャピラリーの結合は一本のキャピラリーの内壁を抗体と水溶性の中性ポリマーで塗り分けることによって作製した。このタイプの抗体カラムは試料の注入速度が遅いという問題点があった。また、陽極液の酸性によって抗体カラムの結合容量がしだいに減少するという問題も見られた。
これらの問題は免疫磁気ビーズを固相抽出担体として用いることによって、解決できた。試料を吸着させた抗体結合免疫磁気ビーズ懸濁液を、脇に磁石を置いたキャピラリーに注入して、キャピラリー内に磁気ビーズを捕捉した。全体を両性担体液で満たした後に、磁気ビーズ部分まで陽極液を注入し、等電点電気泳動を開始することによって、磁気ビーズに吸着していた試料を溶離して高感度に分離検出することができた。
さらに、翻訳後修飾によって等電点が変化した複数の成分を含むエリスロポエチンに対して免疫抽出とキャピラリー等電点電気泳動の結合分析を行い、組換え型エリスロポエチンの等電点パターンを得ることができた。本法に基づいて、簡便で正確なドーピング検査法の開発ができるであろう。
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