2014 Fiscal Year Research-status Report
三次元デジタル電気泳動に基づく生体内タンパク質解析
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26410159
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
末吉 健志 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (70552660)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | デジタル電気泳動 / ミクロスケール電気泳動 / ゲル電気泳動 / 等電点電気泳動 / アフィニティ電気泳動 / タンパク質分析 / オンライン試料濃縮 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、機能性ハイドロゲルを用いた分離分析法であるデジタル電気泳動法の多次元化と、それに基づくウエスタンブロッティングの開発の基盤技術となる、各機能性ゲルの性能評価を行った。
まず、一次元目としてタンパク質の等電点分離を行うデジタル等電点電気泳動において、分離媒体として用いるpH緩衝ゲルについて検討を行った。緩衝能を有する機能性モノマー分子を異なる比率でアクリルアミド溶液に混合して重合させたところ、pH 4～10程度の緩衝能を有する各種ハイドロゲルの調製が可能となった。これを用いたデジタル等電点分離・濃縮を試みたところ、等電点の異なるマーカーやタンパク質の分離と100倍程度の試料濃縮が同時に実現された。
続いて、二次元目にデジタル分子ふるい分離について、異なるモノマー濃度を有するアクリルアミド溶液を用いて、異なる三次元網目構造を有するハイドロゲルを調製し、これを評価用キャピラリー内に積層した。タンパク質試料を積層ゲル充填キャピラリー内に導入した結果、ハイドロゲルの分子ふるい効果によって、分子量の異なるタンパク質が異なるゲル界面に濃縮・分離される様子が観察された。また、この時、未濃縮時の試料と比較して、約150倍の蛍光強度増加が確認された。
三次元目となる抗原抗体反応を利用したデジタルブロッティングについて、抗体固定化ハイドロゲルの調製と、その積層を検討した。その結果、各層に異なるターゲットタンパク質を捕捉、分離することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目標であった各機能性ゲルの基礎的性能評価および積層構造の作製、多層化、分離・濃縮について、概ね計画通り進行しており、今後の多次元化に重要な多くの知見が得られた。さらに、モザイク状に各種機能性ゲルが配置された平板積層ゲルの開発に成功し、二次元化の目途が付いた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は三次元デジタル電気泳動の実現に向けて、前半の二次元部分（等電点電気泳動と分子サイズ分離）と後半の二次元部分（分子サイズ分離と抗原抗体反応に基づくブロッティング分析）に切り分け、それぞれ連続分析に関する知見を収集する。さらには、前半の二次元デジタル電気泳動、後半のデジタルブロッティング分析を、それぞれ既存の二次元電気泳動、ウエスタンブロッティングと比較し、その基礎性能評価を行う。また、それぞれ実試料分析への応用と実用化の可能性を探索する。
平成28年度は、三次元デジタル電気泳動の開発とその実試料分析への応用を進める。三次元化に当たって、二次元積層の延長線上にある三次元立体的な積層法の開発を検討すると共に、カートリッジタイプの機能性ゲルを縦横に組み合わせる、新しい電気泳動デバイスの開発にも取り組む。また、あわせて実試料分析への応用を行う。
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