2016 Fiscal Year Research-status Report
ペプチド・タンパクへの選択性に焦点を当てたフルオラス・分析化学の新機軸
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26410166
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
能田 均 福岡大学, 薬学部, 教授 (20164668)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ペプチド / タンパク質 / フルオラス化学 / 誘導体化 / パーフルオラス化合物 / フルオラスカラム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ペプチドやタンパク質の特定官能基をフルオラスラベル化し、そのフルオラス性を利用して、より簡便により選択的に分析する方法論を確立する。
数種の市販ペプチドをモデル化合物として用いて、ラベル化する官能基の種類（アミノ基、チオール基、グアニジノ基、フェノール性水酸基）、ラベル化の種類（アミノ基に対する各種活性エステル化試薬を用いる方法、アルデヒド試薬による還元アルキル化法；チオール基に対するマレイミド試薬法他）と反応条件の検討、LC分離条件、MS検出条件の最適化他を検討した。結果として、フルオラス試薬としてN-Succinimidyl-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoateを用い、ペプチド内のアミノ基にパーフルオロアルキル基を導入し、フルオラスLCカラム分離し、MS検出行うことで、選択的で簡便な分離分析が可能であった。本方法では、ペプチド中のアミノ基（第１級）の数だけパーフルオロアルキル基が導入され、クロマトグラム上では、その数だけ保持時間が大きくなる。結果的に、アミノ基の数によってペプチドが大別されルことになる。また、第１級アミンを持たない夾雑物質は保持されないため、MS検出において問題となるマトリックス効果による妨害も極めて少ない。
設定した上記条件も基に、脳内に存在する生理活性ペプチド数種を分析する条件を確立した。更に、病態モデルマウスの脳組織の分析に適用し、簡便な前処理で高感度に分析出来ることを確認し、その有用性と実用性を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本来であれば、平成27年度に基本的な条件検討を終えて、研究３年度目の平成28年度に種々の生理活性ペプチドやタンパク質への適用を検討し、研究を完成させる予定であった。
しかし、ペプチドの種類によって、最適な条件が若干相違している項目もあり、個々に再度最適化し、微調整する必要があることがわかり、その条件設定に想定外の時間を費やすこととなった。また、アミノ基に対するラベル化法に関しても、最終的にはN-Succinimidyl 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoateを用いる方法としたが、その他の活性エステル試薬や還元的アミノ化法についても詳細に検討し、時間を要した。さらにはチオール基のフルオラスラベルについても基礎的検討を行った。
上記の状況で結果的に、平成28度では、モデルペプチドを用いた方法論の確立と有用性の実証は出来たが、予定していたペプチド、タンパク質類を対象とした研究の実施には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度までに、フルオラス化学を基盤とするペプチドの高選択的分析は確立されたので、平成29年度は、その方法論を種々の生理活性ペプチドやタンパク質の分析に適用して、その有用性と実用性を検証して研究を完成させる。
対象としては、（１）脳内ペプチド、（２）ペプチド医薬品、（３）ヒト血清アルブミン、（４）抗体、（５）タンパク質製剤 を用いる。対象物質に応じて、アミノ基以外のラベル化も考慮に入れたり、複数のラベル化法を用いることによりフルオラス性を強化する方法も検討して、情報量が多く、選択性の高い分析法として提案していきたい。
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| Causes of Carryover |
本来であれば、平成27年度に基本的な条件検討を終えて、研究３年度目の平成28年度に種々の生理活性ペプチドやタンパク質への適用を検討し、研究を完成させる予定であった。
しかしながら、モデルペプチドを用いた基礎的検討（ラベル化条件、LC分離、MS検出）に想定外の研究期間を要した。特に、ラベルする官能基の種類の選択、ラベル化試薬と反応条件の最適化には、検討項目が極めて多くなり、当初は１年から１年半での完了を予定していたが、２年半の研究期間を要した。結果的に、高額なペプチドやタンパク質試料を購入するに至らず、研究室現有のモデルペプチド、試薬、器具、LC関連消耗品等を使って研究を行ったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額は、最終年度となる平成29年度に全額執行する。
項目別には、物品費が最も多く、ペプチドやおよびタンパク質試料の購入がその大半を占める。更に、タンパク質のLC分離のために新規にゲル濾過カラムを購入する。旅費としては、成果発表のために国内学会２件（薬学関連、分析化学関連）および国際学会(クロマトグラフィー関連）１件への参加を予定している。人件費としては、英語論文校閲の謝金に、その他として論文投稿料や学会参加費への支出を予定している。
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