2014 Fiscal Year Research-status Report
含ケイ素高輝度蛍光剤を活用した蛍光応答型高精度ゲノム解析プローブの開発
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26410173
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
篠塚 和夫 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (20206105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 裕介 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90304302)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光性オリゴDNA / シリル化ピレン / 光励起電子移動 / 一塩基ミスマッチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
5'-末端のA残基にシリル化ピレンが結合する一方、3'-末端には光励起電子移動によってシリル化ピレンを強く消光するC-残基を持ち、これらがダンベル型高次構造中で隣接する一連の蛍光性オリゴDNAを合成した。
これらのオリゴDNAが形成するダンベル型高次構造の熱安定性は、ステム部分の鎖長に依存し、さらにステム部分へのC-5ポリアミンあるいはC-5アントラキノン結合デオキシウリジン誘導体の導入が、熱安定性を大きく向上させることが分かった。一方、完全相補鎖との二重鎖の融解温度(Tm値)はダンベル型構造のそれより10～15度程上昇した。これに対して様々な位置に一塩基ミスマッチを挿入した相補鎖との二重鎖では、ミスマッチの位置により変化するものの、全て完全相補鎖に比べて10～15度程低下した。
さらに、相補鎖非存在時、完全相補鎖存在時、ミスマッチ相補鎖存在時における蛍光性オリゴDNAの蛍光シグナルを測定した結果、得られた一連の蛍光性オリゴDNAは、相補鎖非存在時には全て微弱な蛍光シグナルを発するものの、完全相補鎖存在時にはそのシグナルが10倍～60倍に増強することが判明した。これに対してミスマッチ相補鎖存在下での蛍光シグナルの増強は6倍～35倍と幅があった。詳しい研究により、この蛍光回復にはC-残基とシリル化ピレンステムの近接を実現するステム部分の熱安定性、ステム部分に導入したアントラキノンによる光励起電子移動効果などが関与していることが判明した。以上の成果は２本の査読付き論文として発表した。
クリック反応を応用してオリゴDNA中にシリル化ピレン結合ユニットを導入するため、アジド基を持つ新規なシリル化ピレン誘導体の合成に成功した。合わせて、蛍光量子収率が大幅に向上した、シアノ基を持つ新たなシリル化ピレン誘導体の合成に成功した。これらの成果の一部は査読付き論文として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度当初計画では、5'-末端のA残基にシリル化ピレンが結合する一方、3'-末端には光励起電子移動によってシリル化ピレンを強く消光するC-残基を持ち、これらがダンベル型高次構造中で隣接する一連の蛍光性オリゴDNAの合成を計画した。さらに、２７年度においてダンベル構造や完全相補鎖、一塩基ミスマッチ相補鎖などとの二重鎖の熱安定性の解明、並びに相補鎖非存在時、完全相補鎖存在時、ミスマッチ相補鎖存在時における蛍光性オリゴDNAの蛍光シグナルの変化について解析する計画であった。実際には本年度の研究において必要となる一連の蛍光性オリゴDNAの合成に成功し、更にこれらを用いて２７年度において実施予定であった一連の研究を２６年度中に実施することができた。さらにこれらの成果を２本の査読付き論文として刊行することができた。
２６年度中に計画していたクリック反応を応用してオリゴDNA中にシリル化ピレン結合ユニットを導入するため、アジド基を持つ新規なシリル化ピレン誘導体の合成については、計画通り実行することができた。合わせて、蛍光量子収率が大幅に向上した、シアノ基を持つ新たなシリル化ピレン誘導体の合成に成功した。これらの成果の一部は査読付き論文として発表することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度に計画していた、ヒトパピロマウイルスの遺伝子診断への応用を見据えた研究に就いて、２７年度に前倒しで実施していく。
本研究では、２６年度に得られた、ダンベル型高次構造を形成するシリル化ピレン結合蛍光性DNAの研究による成果と知見を基に、子宮頸癌の原因となるヒトパピロマウイルスについて、特にガン発症リスクの高い幾つかの亜型の遺伝子診断への応用の可能性に就いて明らかにして行く。
クリック反応を応用して、近接した位置にシリル化ピレン結合ユニットを導入した蛍光性オリゴDNAプローブの研究に就いては、当初の計画通りに進めて行く。
また、リアルタイムPCR法に適用でき、消光剤が不要な新規な蛍光性オリゴDNAプローブ研究に就いても、当初計画通り実施して行く。
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| Causes of Carryover |
２６年度研究では大きな問題無く計画通りの研究が進展し、かつ効率的な執行が行えたことから小額の残額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額については、消耗品費予定額に組み込んで、合わせて執行して行く。
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