2015 Fiscal Year Research-status Report
単量体と二量体の動的平衡状態にあるGPCRが伝達する生物活性情報の特定
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26410182
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| Research Institution | Saga University |
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Principal Investigator |
兒玉 浩明 佐賀大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80205418)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長田 聡史 佐賀大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50284609)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / GPCR / 二量体 / ペプチド合成 / 活性酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、ヒト好中球等の細胞膜上に発現している受容体タンパク質の多量体形成を、化学合成したヘテロ二量体ペプチドを用いて特定することを試みる。まず、昨年度開発したホルミルペプチド受容体の２つのサブタイプFPR1とFPR2に選択的なペプチドを架橋した二量体の受容体サブタイプへの選択制を評価した。ヘテロ二量体１分子は、FPR1に選択的なアゴニスト１分子とFPR2選択的アゴニスト１分子の都合２分子に相当する。そこで、ヘテロ二量体の生物活性を、各サブタイプに選択的なペプチドの等モル混合物と比較した。その結果、単純に２種類のペプチドを混合したものと比較して、有効薬物濃度EC50値と最大活性の両方が優位に増大した。この結果からヘテロ二量体が単純に単量体として振る舞っているのでは無く、１分子に２つの薬理学的コアが含まれる分子として単量体とは異なる振る舞いをしていることが示唆された。これまでの結果から、ヘテロ二量体１分子は２つのサブタイプの結合サイトと同時に相互作用していることが期待された。
また、FPR2受容体に選択的なアンタゴニストを光架橋アミノ酸で置換した誘導を合成した。光架橋アミノ酸としては、申請者らが既に実績を持つ、p-ベンゾイルフェニルアラニンを用いた。ペプチド合成は迅速に生成物を得るため、Fmoc固相合成法をでおこなった。アミノ酸の縮合はHBTU-HOBt法で、Fmoc基の除去はピペリジンを用いた。ホルミル基はギ酸-EEDQ法で導入した。脱樹脂後、HPLCで精製した。ペプチドの構造はMALDI-TOF MSで確認した。得られたペプチドの生物活性は、分化HL-60細胞を用い、細胞内カルシウム濃度変化として評価した。光架橋アミノ酸を含むペプチドは、高い生理活性を示し、また、fMLPにより脱感作されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究計画にある、ホルミルペプチド受容体の２つのサブタイプに選択的なアゴニストを共有結合した経てる二量体が、２つの受容体サブタイプFPR1とFPR2 の両方と相互作用していることを明らかにした。また、光架橋アミノ酸を含むペプチドの開発が計画通り進んでいるから。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は、ヘテロ受容体タンパク質構築を詳細に検討する。現在まで申請者は、好中球受容体の７回の膜貫通部位のうち、Ｎ末端用い、アゴニストやアンタゴニストの生理活性を調べ、受容体の会合を調べる。から４番目の膜貫通部位の配列を持つペプチドで前処理したヒト好中球が、アゴニストを単独で投与した場合に比べ高い生物活性を発現することを見いだした（J.Biochem.2006）。これは膜貫通ペプチドが受容体タンパク質の膜貫通部と特異的に相互作用することで受容体を前活性化（プライミング）状態に変換させていると考えられている。今回はヘテロ膜貫通ペプチドの生理機能を精査する。ヘテロ膜貫通ペプチドを優位に受容体と相互作用するペプチドでは、光架橋アミノ酸を含むペプチドを再度合成し、ペプチドが相互作用するタンパク質を特定する。膜タンパク質架橋の研究は種々報告があるがヘテロ二量体によるヘテロなタンパク質を架橋した例はほとんど無い。この場合は反応性の異なる二種類の光架橋アミノ酸をそれぞれ別々にヘテロ膜貫通二量体の膜貫通領域に挿入し別々に光架橋を試みたい。
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| Causes of Carryover |
今年度予定していた化学合成が順調に進んだため、当初購入を計画していた試薬類が節約できた。また、一方、生物活性評価は、細胞に発現している受容体サブタイプの確認に時間を要したため、一部計画を変更したため、消耗品の使用が少なくなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、当初の計画通り相互作用する受容体の特定を行うが、測定対象となる有用な化合物が計画以上に多数開発出来たため、評価に必要な消耗品にあてる。
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