2015 Fiscal Year Research-status Report
ホタルルシフェリン生合成経路の解明とキラルフリー発光システムへの応用
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26410185
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
加藤 太一郎 鹿児島大学, 学術研究院理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丹羽 一樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (30443211)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / ホタル / 生物発光 / 生合成経路 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ホタルD-ルシフェリンの生合成経路を解明すると共に、生合成経路を利用したキラルフリー発光システムの構築を目的とした研究を行う。ホタル体内では、発光基質D-ルシフェリンがその鏡像異性体であるL-ルシフェリンの立体反転によって調製されるという仮説のもと、本プロセスに関与する遺伝子群をトランスクリプトーム解析によって特定することを試みると共に、その遺伝子群を利用してD-, L-ルシフェリンのいずれからでも発光するキラルフリーシステムを構築し、細胞を用いたin vivoイメージングへと応用することを目指す。
昨年度までに申請者らは、モデル反応として細菌由来チオエステラーゼ(加水分解酵素)と、ホタルルシフェラーゼ(上記経路中のチオエステル化酵素に対応)をin vitroにて組み合わせたデラセミ化反応系を作成し、L-からD-体への立体反転を伴った発光反応が進行することを確かめていた。またゲンジおよびヘイケボタル成虫に対するトランスクリプトーム解析(遺伝子発現解析)を行った(本解析はゲノム支援(文部科学省科学研究費新学術領域研究「生命科学系３分野支援活動」)に採択されたため委託した。)
本年度は、得られた次世代シーケンスデータをアセンブルし、ホタル発光器内で発現しているタンパク質を予想した。その結果、目的と合致すると考えられる複数のチオエステラーゼ遺伝子の存在を確認することができた。そこで、これらのうち、遺伝子番号m38228を含む2種類を選択しcDNAを作成、クローニングし、大腸菌にてタンパク質発現を試みた。その結果、発現量は少ないながらタンパク質を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ホタルは非常に有名な発光生物であるが、その基質、D-ルシフェリンの生合成経路は謎に包まれている。今回申請者らは、本発光基質が、ホタル体内にてその鏡像異性体であるL-ルシフェリンから立体反転を伴ったデラセミ化反応によって合成されているという仮説を立てている。つまり、まずチオエステル化酵素によってL-ルシフェリンとCoASHからチオエステル体を生成する。次に、本チオエステル体に対してエピメリ化酵素が作用、立体が反転し、最後に加水分解酵素によってD-ルシフェリンが得られるという経路である。申請時にはすでに最近由来のチオエステラーゼを利用したモデル反応系を構築し、反応の進行は確かめていたが、実際にホタル体内にチオエステラーゼが存在するかは不明であった。昨年度までの成虫を用いたトランスクリプトーム解析で、チオエステラーゼがホタル体内に存在しうることを確認できたため、今年度はそれらをクローニングし、大腸菌にてタンパク質を発現させた。これによってチオエステラーゼタンパク質を用いてL-ルシフェリンからの発光反応が進行することを確認し、申請者が提唱したデラセミ化経路がホタル体内で実際に存在していることを確かめるための準備が整った。よって本年度の研究は、当初の予定通り順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
トランスクリプトーム解析の結果から予想された複数のチオエステラーゼ候補のうち、今年度は遺伝子番号m38228をはじめとする2種類のタンパク質発現を確認することができた。よって次年度は他の候補酵素遺伝子のクローニングを試みると共に、in vitroアッセイでのキラルフリー発光システムの作動確認を行う予定である。これらの中からL-体から効率よく発光するシステムを構築するための最適な組み合わせ、あるいは酵素量比を調べると共に、in vivoでも本デラセミ化反応が進行するのか確かめることを計画している。またゲンジおよびヘイケのゲノム解析を進め、先のトランスクリプトーム解析の結果と合わせて、より詳細な発現解析ができる環境を整える。
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| Causes of Carryover |
初年度にサーモフィッシャーMultiskan GOアドバンス(1,300千円)の購入を計画していたが、初年度の申請代表者の所属機関の異動に伴い購入を行わなかったこと、また、トランスクリプトーム解析についてはMacrogen Japanに委託する予定であったが、ゲノム支援(文部科学省科学研究費新学術領域研究「生命科学系３分野支援活動」)に採択されたため費用負担なしにて解析していただけたという理由から、当初予定の支出額より少額にて研究を推進することが可能となり、今年度も予算の次年度使用額が生じた。一方、前任地の兵庫県立大学の学生(共同研究者)の実験を円滑に進めるために鹿児島大学にて実験を行うための旅費が計画より多く必要となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記により来年度に繰り越す予算は、物品購入や、共同研究者の学生との打ち合わせ旅費や国際学会参加旅費として利用したいと考えている。
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[Presentation] ホタルルシフェリンの簡便な化学発光システム2015
Author(s)
加藤太一郎, 白川大暉, 丹羽一樹, 武尾正弘, 根来誠司, 伊東祐二
Organizer
生物発光化学発光研究会第32回学術講演会
Place of Presentation
電気通信大学附属図書館マルチメディアホール(東京都調布市)
Year and Date
2015-10-31 – 2015-10-31
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[Presentation] キラルフリーホタル発光システム2015
Author(s)
加藤 太一郎, 奥田 真利, 丹羽 一樹, 武尾 正弘, 根来 誠司, 伊東 祐二
Organizer
第67回日本生物工学会大会
Place of Presentation
城山観光ホテル(鹿児島県鹿児島市)
Year and Date
2015-10-26 – 2015-10-28
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