2014 Fiscal Year Research-status Report
2次元クロマトグラフィーと超高感度アミノ酸分析による翻訳後修飾の絶対定量法の研究
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26410190
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| Research Institution | National Maritime Research Institute |
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Principal Investigator |
益田 晶子 独立行政法人海上技術安全研究所, その他部局等, 研究員 (10322679)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堂前 直 独立行政法人理化学研究所, その他部局等, 研究員 (00321787)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 固体酸触媒 / 加水分解 / タンパク質 / アミノ酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
液体サンプル用の固体酸触媒の性能評価を中心に研究をおこなった。スチレン・ジビニルベンゼン共重合体を基材とする強陽イオン交換樹脂を用い、バッチ法でタンパク質の加水分解テストをおこなった。加水分解時間を変えて回収率、アミノ酸組成を評価したところ、従来の塩酸法と同等のアミノ酸回収率を得るためには、加熱温度は150℃、加熱時間は1時間が最も良いことがわかった。また、樹脂の加水分解能力を調べるため、一定量の樹脂（樹脂50%懸濁液を10マイクロリットル）を用いてタンパク量を変えて加水分解実験を行ったところ、牛血清アルブミン（BSA）は100マイクログラム程度まで定量的に加水分解ができることが明らかになった。したがって、1gのタンパク質を加水分解するためには100mL程度の樹脂が必要となる。バイオマスや食品分野などのマクロ量タンパク質の加水分解によるアミノ酸、ペプチド産生に資するために、今後スケールアップしての加水分解実験も行う予定である。また樹脂からの回収率は抽出溶液にも依存するため、抽出液の最適化を行ったところ、１Nの水酸化ナトリウム水溶液で効率よく抽出できることがわかった。また、一定量のBSAに対し樹脂量を増やしていくと回収率が減少することから、タンパク量/樹脂比が重要であることもわかった。これらの結果から、固体酸触媒を用い、適切な条件で加水分解とアミノ酸抽出を行えば、定量的なタンパク質加水分解およびアミノ酸組成分析が可能であることを示せた。
また、この樹脂をカラムに充填しカラム内加水分解を行った。回収率はバッチ法よりも低く70％～50％程度だった。これはインジェクション時に素通りしてしまう成分があるからであることがわかったため、インジェクション方法を変更するか、樹脂とタンパク質溶液の接触面積を増やすため樹脂粒径を小さくするなどの改善策を行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的であった、液体サンプル用の固体酸触媒の性能評価を完了し、従来法の塩酸法と同等のタンパク質加水分解条件を確立することができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹脂を用いたカラム加水分解の効率を上げるため、タンパク質の導入方法を考案する。また、電気泳動サンプルにも応用できるよう、膜状固体酸触媒の開発をし、性能評価を行う。
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| Causes of Carryover |
消耗品（タンパク質および固体酸触媒原料）の購入が当初見積より少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は、新たな膜状固体酸触媒を開発するほか、加水分解キット作製を計画している。加えて前年度の課題として樹脂を用いたカラム加水分解の効率を上げるため、タンパク質の導入部分の構築が必要となったため、前年度繰り越し予算を使用する。
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