2014 Fiscal Year Research-status Report
「補酵素A再生系」に基づく高光学純度ヒドロキシ酸の高効率生産
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26420791
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大井 俊彦 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40223713)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 謙一郎 北海道大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80360642)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒドロキシ酸 / 3-ヒドロキシ酪酸 / 高光学純度 / キラル / 微生物生産 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高光学純度のヒドロキシ酸を生産する新規なプロセスとして、これまでにP(3HB)生合成経路の中間体である3HB-CoAのCoAを酢酸に転移しアセチル-CoAを生成する酵素(PCT)を利用した(R)-3HB生産法のプロトタイプを我々グループが開発していた。このプロトタイプではグルコースを用いて最大5g/Lの(R)-3HB生産性を示すが、さらに代謝工学および酵素進化工学の両面から生合成経路を強化することで、高効率に(R)-3HBを生産する微生物工場を創生することを目的としている。本年度は、このプロトタイプの生産系を基盤としてさらに高効率に高光学純度の(R)-3HBを生産するための宿主大腸菌の選択を中心に行った。目的に叶う宿主大腸菌として、グルコースの代謝速度の高い宿主大腸菌を選択した。各種遺伝子型の異なる大腸菌に対して（R)-3HB生産関連遺伝子を保持するプラスミドを導入した。次いでグルコースおよび酢酸を添加した基本培地を用いて培養を行い、グルコースの消費量および(R)-3HBの生産量の高い宿主大腸菌を選抜した。その結果、大腸菌JM109株がグルコース消費速度と(R)-3HB生産性の観点から最適な宿主として選択された。
次いで合成経路中の律速反応に関わる酵素を推定するためには整合性中間体の定量分析が必須となることから、3種のCoA体(アセチル-CoA、アセトアセチル-CoA、および3HB-CoA)の細胞内からの定量的な抽出方法について検討した。これら不安定なCoA体は集菌後、氷冷したアセトニトリルを利用した抽出法を採用することで、精度よく定量分析するための基盤を作ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画であった(R)-3HB生産性の強化を目的として、グルコーストランスポーターを強化した宿主大腸菌による効果を検討したが、予想に反して(R)-3HBの生産性が下がる傾向を示した。現在まだ検討中であるが、代替として遺伝子型の異なる大腸菌宿主に(R)-3HB生産遺伝子群を導入して生産性を検討することになったした。
H27年度以降に計画している律速酵素の特定のに関しては、定量分析の対象としている合成中間体の3種のCoA体が不安定であったため、文献にある抽出法では定量性が確保できなかったので多くの検討が必要であった。現在まだ完全とは言えないがほぼ満足できる抽出法が確立できてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(R)-3HB生合成に関わる３種の酵素反応のうちどの反応が律速となっているかを特定するために、３種のCoA代謝中間体（アセチル-CoA、アセトアセチル-CoA、および3HB-CoA）の細胞内プール量をLC-MSにより定量し代謝フラックス解析を試みる。細胞内に蓄積された代謝中間体を生成する酵素を特定できたら、次の段階としてその強化を試みる。
現在までに、これら３種の酵素反応の中でCoAの転移反応を触媒するPCTおよびアセトアセチル-CoAから3HB-CoAの反応を触媒するPhaBの２種の酵素が律速である可能性が高いデータが見え始めているので、これら酵素に関して、そのライブラリーから進化工学的アプローチにより該当遺伝子にランダム変異を加えたライブラリーを作成し、高活性変異体をスクリーニングする。酵素活性測定によって高活性体であることを確認したうえで、これまでの(R)-3HB生産に利用してきた野生型酵素斗置き換え、(R)-3HB生産量を比較してその効果を検証していく。加えて野生型酵素および高活性変異酵素による生産においての、代謝フラックス解析の比較によって、、(R)-3HB生産においての効果を検証する。
また、律速酵素を強化した微生物工場を高質できたら、培養工学的なアプローチによって生産増強を試みる。具体的には添加するグルコースおよび酢酸の添加濃度や添加時期が生産性に大きく影響することが予想されるため、特に培養液中の酢酸濃度が高くなって生育阻害を示さず、(R)-3HBの効率生産可能な培養条面を見出していく。
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| Causes of Carryover |
H26年度は計画していたトランスポーター欠損株の評価に関わる実験経費が想定以上に少なくなった。加えて、反応中間体の抽出等に関しても同様に試料作成や分析に要する支出が少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画には大きく問題にならない範囲で進捗しており、今後予定しているLS-MSを利用した律速反応の同定および推定された律速酵素の機能強化に集中し、当初の研究計画を前倒しして実行し繰越予算を支出する計画としている。
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Research Products
(2 results)
