2014 Fiscal Year Research-status Report
未分化性が高く均一なヒトｉＰＳ細胞を取得するための新規培養法の開発
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26420794
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
黒澤 尋 山梨大学, 総合研究部, 教授 (10225295)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
望月 和樹 山梨大学, 総合研究部, 准教授 (80423838)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / 低酸素 / ノコダゾール / 細胞周期 / 同調培養 / 未分化維持 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、未分化性の高い均一なヒトiPS細胞を得るため、同調培養と低酸素培養を応用した新規な培養法の開発を目指すものである。平成26年度研究計画は、1）ノコダゾール処理によって細胞周期とエピゲノム状態が揃うことを確認する、2）低酸素環境が未分化維持に有効であることを確認する、であった。
１, 「ノコダゾールによる細胞同調」に関する検討の結果、ヒトiPS細胞の細胞周期を同調させるには、フィーダー細胞を用いない系で、細胞にノコダゾールを作用させる必要があることがわかった。無フィーダー系でヒトiPS細胞をノコダゾール処理することにより、細胞周期がM期の細胞の割合が高まることが明らかとなった。ノコダゾール処理の濃度は400 ng/mlが、処理時間は８時間が適当であった。ノコダゾール処理は、細胞周期の観点からは細胞の均一性を高めたが、処理前後における未分化関連遺伝子の発現量には大きな差異は見られなかった。よって、ノコダゾール処理が細胞の未分化性を高めたか否かについては明確にできなかった。しかし、ノコダゾール処理により、脱未分化細胞が死滅する兆候が見られた。
２, 「低酸素環境」に関する検討の結果、今回の低酸素条件（５％O2）は、ヒトiPS細胞の未分化性及び増殖性遺伝子に影響を与えないことが明らかとなった。細胞収量及びコロニー細胞密度に関しては、むしろ低酸素濃度より通常酸素濃度で培養した方が良好であった。しかし、生体内で幹細胞が存在するといわれる環境（ニッチ）は、低酸素環境であるとされていることから、酸素はヒトiPS細胞の質に影響を及ぼす環境因子であることは間違いない。今後は、さらに低酸素環境（１％O2）下での検討を行うなど、さらに詳細に低酸素環境下におけるヒトiPS細胞の挙動を調べる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「ノコダゾールによる細胞同調」 無フィーダー系でヒトiPS細胞をノコダゾール処理することにより、細胞周期がM期の細胞の割合が高まることが確認できたことは、重要な成果である。細胞同調率が最も高くなるノコダゾール処理条件（400 ng/ml、8時間）も決定することができたことから、ほぼ計画通りに研究が進展したといえる。しかし、同調した細胞の均一性や細胞発生上のメリットを示すには至らず、エピゲノム解析の結果を得ることができなかった。
「低酸素環境」 平成26年度に予定して検討はすべて実施できたが、今回の低酸素条件（５％O2）は、ヒトiPS細胞の未分化性及び増殖性遺伝子に影響を与えないことが明らかとなり、期待した結果を得ることはできなかった。しかし、低酸素環境を作り出す培養系は予定通り確立できたことから、次年度以降は、より低酸素環境の影響を検討したり、培養する細胞の条件を種々変えることによって、低酸素の影響が顕著に現れる事象を見いだすことができると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究により、ヒトiPS細胞の無フィーダー培養が安定的に行えるようになった。細胞周期を同調させるには、無フィーダー系で培養したヒトiPS細胞をノコダゾール処理するのが有効であることがわかった。ゆえに、今後は、無フィーダー系で培養したヒトiPS細胞を用いて実験を行うことにするため、実験が前年度よりも順調に進むと見込まれる。ノコダゾール処理により細胞周期の同調が起こることが確認されているので、何らかの変化が細胞に生じていると思われる。また、ノコダゾール処理により、脱未分化細胞が死滅する兆候が見られたことから、脱未分化細胞をノコダゾール処理で除去できる可能性が考えられる。よって、今年度は、意図的に脱未分化を起こさせた細胞にノコダゾール処理を施し、処置前後の細胞状態の比較、未分化関連遺伝子の発現量測定、及びエピゲノム状態変化の解析を行う予定である。
低酸素環境はヒトiPS 細胞の未分化維持と分化制御に関わる重要な因子であると思われる。前年度の実験では５％O2下での継代培養についてのみ検討したが、今年度はさらに低酸素領域（１％O2以下）での、細胞挙動を検討する。細胞挙動の解析にはタイムラプス観察も取り入れ、細胞遊走の様子が周囲の酸素濃度によってどう影響を受けるのかを調べる。また、低酸素環境が細胞分化に及ぼす影響についても検討する。低酸素関連遺伝子（Glut1、Ldh1）の発現状況も調べる予定である。
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