2016 Fiscal Year Annual Research Report
Imobilization of scFv through SiN-binding peptide for sensitive RIfS sensor
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26420795
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
熊田 陽一 京都工芸繊維大学, 分子化学系, 准教授 (70452373)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 窒化ケイ素 / 単鎖抗体 / 材料親和性ペプチド / 配向制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、反射干渉分光センサのセンサチップ表面において、抗体、酵素などの機能性タンパク質を高密度・高配向・高活性に固定化可能なペプチドタグの探索、ならびに、一本鎖抗体の固定化技術の開発を行った。センサチップに利用されている窒化ケイ素SiN表面に対し、大腸菌可溶性タンパク質を用いて吸着操作を行った後に、二次元電気泳動で吸着タンパク質の分離・同定を行った。その結果、SiN吸着性タンパク質としてElongation Factor Tu（ELN）が同定された。ELNをプロテアーゼでペプチド断片に分解し、付着性のあるペプチド断片の行ったところ、複数種類のペプチドが高い付着性を保持していることが明らかとなった。さらに、同定されたSiN-binding peptideをモデルタンパク質であるGlutathione S-transferase (GST)のC末端部に導入し、これらの融合タンパク質のSiN基板表面への付着性をRIfSセンサを用いて比較検討したところ、3種類のペプチド断片が、GSTに融合した後においても付着性を高く保持していることが明らかとなった。特に、最も付着性が高かったELN-TP14とELN-V821は、アミノ酸配列が重複いることから、これらに保存されているアミノ酸配列がSiN基板表面に対して高い付着性を保持していることが明確となった。
ELN-V821をC末端に融合した単鎖抗体を組換え大腸菌によって生産し、封入体からタグ付きscFvを回収後、リフォールディングによって立体構造を回復させた。SiN-tag融合scFvを固定化したRIfSセンサチップを用いて抗原検出を行ったところ、タグなしscFvと比較して大幅に検出感度が向上した。
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Research Products
(1 results)
