2015 Fiscal Year Research-status Report
燃料作物ジャトロファの安全性評価に基づく抗発がんプロモーション活性物質の取得
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26420801
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
梶山 慎一郎 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (20243496)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), その他部局等, その他 (60314415)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | Jatropha curcas / phorbol ester / tumor promotion / anti tumor promoter / molecular probe |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは，次世代バイオ燃料植物として多くの利点を有するジャトロファ（Jatropha curcas）の安全な普及をめざし，本植物が産生する発がんプロモーション活性物質であるホルボールエステル類（PE類）の毒性の詳細な検討や安全性の評価を行ってきた。この過程で本植物の代謝産物中には，強力な発癌プロモーション活性を持つことが知られるPMAの作用を逆に抑制する作用を持つ代謝産物が存在することを見いだした。昨年度（H26年度）はこの作用が本植物の産生するどのような代謝産物に起因するのかを調べる目的で，PE類を生産しない無毒株の抽出物を用いた活性評価を行った。その結果，無毒株抽出物は，マウス皮膚2段階試験においてPMAによる発がん効果を抑制せず，有毒株抽出物がPMAの作用を有意に抑制することを合わせて考えると，この抑制効果がジャトロファのPE類に起因していることを示唆した。この結果を受けてH27年度は，活性の指標としてマウス皮膚2段階試験と共に頻用されるRaji細胞のEBV-EA（Epstein-Barr virus早期抗原）誘導試験を用いて同様の結果が得られるかを検討した。Raji細胞は，EBVゲノムを保有し，PMAなどの発癌プロモーターで処置することにより，EAが誘導されるため，このEAを間接的蛍光抗体法によって検出することにより活性評価が可能である。一方，本方法は，EA発現細胞を蛍光顕微鏡により観察し，蛍光を発する細胞を計数することによって評価を行うため，計測数に限りがあることや，判断が目視のため，実験者によって結果に差が出てしまうなどの問題がある。そこでまず，EAの間接的蛍光抗体法での検出をフローサイトメトリー（FCM）で行う方法の検討を行った。さらに，別法としてリアルタイムPCRを用いたEAのｍRNAの定量解析による活性評価を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず，EAの間接的蛍光抗体法での検出をフローサイトメトリー（FCM）で行う方法の検討では，ポジティブコントロールとしてPMAを用い，Raji細胞に対して48時間のEA誘導を行ってEA抗体および二次抗体によって蛍光標識した。このときPMAの培養液添加に伴い細胞に形態変化が生じることが観測された。この形態変化はJatropha抽出物を添加したものでも観察された。Raji細胞は浮遊細胞であるが，形態変化したものは接着性を示した。この接着性はFCMにおける計測にも影響し，見かけ上の細胞の大きさが変化するため正確な計測を行うには，剥離処理等の前処理の検討が必要である事が判った。一方，この細胞の形態変化は，発がんプロモーション活性物質の多様な作用の一つと考えられ，形態変化そのものや，これに伴う細胞骨格の変化を捉えた新しい発癌プロモーション活性評価や，化学発癌のメカニズム解明への示唆を与えるものであった。一方，EA関連遺伝子発現のリアルタイムPCRによる定量化を用いた活性評価法の検討では，コンパレイティブCT法によりGAPDHとの相対発現定量の解析を行った。その結果，バックグランドでの発現はほぼ無く，ジャトロファ代謝産物ではPMAの約1/5の EA関連遺伝子（BRLF-1）の発現が見られ，本法は発癌プロモーション活性の定量化に利用可能である事が判った。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度および今年度の結果から，ジャトロファの代謝産物中に存在する発がんプロモーション効果を抑制する物質は，ジャトロファのホルボールエステル類に起因する拮抗作用に基づくこと，さらに，Raji細胞のEBV-EA（Epstein-Barr virus早期抗原）誘導試験においても，ジャトロファ代謝産物の活性評価が可能であることが示された。一方，処理細胞の形態変化の観察から，発がんプロモーション活性物質の多様な作用の一つと考えられ，これは，より簡便な形態変化そのものを活性評価の指標とする方法の開発や，形態変化に伴う細胞骨格の変化を捉えることにより化学発癌のメカニズムの解析にも応用可能と考えられることから，来年度以降はこの点について検討を行う。また，分子構造と活性の詳しい相関関係についても知見を得るため，ジャトロファの産生するホルボールエステル分子種の単離をよび，分子種毎の活性評価を試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
H28年度以降研究進行に伴い化合物の分析用試薬，HPLCカラム等の購入が増える事，および，構造活性相関解析に着手するため，このために用いるソフトウエア購入が必要となることからH27年度は最小限の支出とし，残額の次年度予算への繰り越しを行った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度予算の大半は，分析試薬，HPLCカラム等の消耗物品購入に充てる。また，構造活性相関解析用ソフトウエアの購入を計画している。
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