2015 Fiscal Year Research-status Report
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26430005
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Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
野口 潤 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40421367)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 樹状突起スパイン / 蛍光寿命画像顕微鏡 / FRET / 2光子顕微鏡 / プレシナプス |
Outline of Annual Research Achievements |
記憶・学習の基礎過程であるシナプス可塑性は、誘導から数時間程度の分子シグナル過程が特に明らかにされつつある。シナプス後部であるスパインは可塑性の誘導によって形態が変化するが、この形態変化による機械的な刺激そのものがシナプス後部から前部へと比較的早く可塑性の情報を伝達し、短時間に成立する記憶学習に貢献するという仮説を我々は考えている。 これを検討するためにシナプス前部のシナプス伝達効率を生きた標本で定量的に評価する必要があり、方法論の開発にまず取り組んだ。具体的にはFRET (Forster resonance energy transfer) / FLIM (Fluorescence lifetime image microscopy) 法を用いて、シナプス前部の伝達効率を表す指標であるSNAREタンパク質複合体形成を検出するプローブ(iSLIM)の開発と評価を行った。26年度から継続してこれを実施し、結果をNature Communications誌に27年度論文報告した。 海馬培養スライス標本においてシナプス前部機能を可視化してみると、シナプス前部のふくらみ(synaptic bouton)の一部分にSNARE複合体形成の高い場所が存在することがわかった。我々はこの場所はactive zone(シナプス間隙に面して神経伝達物質を放出する部分)を含む領域であると考え、このプローブよって2つの神経細胞がシナプス結合を形成していることを判定可能か否かを試みた。予備的な実験では、シナプス後部局在タンパク質PSD95と、シナプス前部機能プローブは、近接して局在する場合が観察された。このことから、このプローブはシナプス形成判定に有用であると考えている。光学顕微鏡によるシナプス形成の判定は、コネクトミクス(神経結合の網羅的解析)にも応用可能で、生体への適用も含めて今後も検討を継続する。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 実験系の確立:27年度も前年度に引き続き実験系の再現性・定量性の向上を試み、FRET /FLIMによるシナプス前部機能プローブ(iSLIM)に関して論文発表を行った。本プローブによりシナプス前部の光学顕微鏡による機能測定が可能となった。また、使用している顕微鏡は、青-赤領域(460-630 nm)の蛍光を検出できたが、新たに赤外の蛍光を検出できるような光学系を追加した。これによって、プローブ由来の蛍光以外の光学的情報をより多く同時に取り込むことが可能となった。 2.シナプス前部機能プローブ(iSLIM)の評価:今回掲載された論文において、我々は、SNARE複合体を形成する操作を行うとこのプローブの蛍光寿命が変化することを示し、培養海馬スライス標本錐体細胞における計測値から、静止状態におけるdockedシナプス小胞あたりのSNARE複合体の数を試算することにも成功した。また、このプローブはSNAREタンパク質のノックダウンをレスキューすることができたことから由来するSNAREタンパク質の機能をこのプローブが保持していることも確認した。このプローブにより、興奮性神経細胞のシナプス小胞とインシュリンを分泌するβ細胞の分泌様式の違いも明らかにできた。 3.シナプス前部機能プローブを用いたシナプス結合の判定:今回開発したプローブを利用して多くの神経線維の重なりにおいてシナプス結合の有無を評価する試みを実施した。シナプス後部のみを標識するためにPSD95-mCherryタンパク質を樹状突起スパインに発現させ、SNARE複合体を検出するシナプス前部機能プローブをシナプス前部に発現させた。予備的な実験では、シナプス後部局在タンパク質PSD95と、シナプス前部機能プローブは、近接して存在する場合が観察された。このことから、このプローブはシナプス形成判定に有用と考えている。
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Strategy for Future Research Activity |
これまでに取り組んできた課題に加えて以下の事項に重点的に取り組む。 1. 実験系の確立:測定系の調整は継続して進める。バックグラウンドのノイズがより少ないプローブを作製し、より信頼性の高いシグナルが得ることを目論む。 2.シナプス前部機能プローブを用いたシナプス結合の評価:本プローブは光学顕微鏡を用いたシナプス結合の有無の判定に有用と考えるので、解析を進め、将来的に学会あるいは論文発表することを目論む。 3.シナプス可塑性時の可塑性の広がりの解析について:シナプス可塑性はシナプス後部から前部に伝わるだけではなく、シナプス後部において樹状突起内を伝播し他の樹状突起スパインに影響を与える場合がある。我々は可塑性の樹状突起に沿った伝播についてcofilinというアクチン切断タンパク質に着目して分析を行った。その結果、リン酸化されたcofilinのスパインからの拡散が未刺激状態と可塑性刺激を加えた状態で異なることを見出した。この機構はスパイン形態可塑性を制御するので、シナプス前部にも影響を与える。本研究課題の基盤となる知見であるので、解析を進め論文投稿を目指す。 4.in vivo(生体)におけるシナプス可塑性誘導:ケージドグルタミン酸を用いたスパイン形態可塑性をin vivoで誘導させたときの性状の詳細な解析は十分に報告されていない。今後in vivoにてスパイン形態可塑性を生じさせて、このときのシナプス前部への広がりの解析を行うとき、特に大脳皮質等におけるスパイン形態可塑性の性質を知ることが重要となる。そこで、caged化合物を用いたin vivoシナプス可塑性の誘導について解析を進め、論文投稿を目指す。
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Causes of Carryover |
研究実施の都合上、本年は消耗品の購入価額等が予定よりも少なかった。また、予定していた北米神経学会への参加を研究進行の都合上見合わせた。
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、今年度に実施しなかった課題項目の実施により目論見通りの消耗品価額を使用する予定。
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