2014 Fiscal Year Research-status Report
分子発現パタンに注目した自閉症関連小脳神経回路の解析
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26430035
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
藤田 啓史 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 非常勤講師 (60725901)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉原 泉 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (60187656)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マウス / 小脳 / 神経回路 / Pcdh10 / 自閉症スペクトラム障害 / 形成過程 / プルキンエ細胞 / 小葉 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、自閉症スペクトラム障害(ASD)と関連の強い小脳第VI-VII小葉における神経回路の特異性を解析することを目的としている。ASD関連遺伝子のプロトカドヘリン10 (Pcdh10)は、小脳の発達期から第VI-VII小葉を中心とする特異な縦縞状のパタンの領域に発現するので、特に、Pcdh10発現がレポーター発現で標識されたマウス（OL-KOマウス）を用い、Pcdh10発現区画の構築とその発生過程、入出力軸索投射を詳細に解析することが研究の中心である。
OL-KOマウスを用い、胎仔期小脳から成獣までPcdh10発現区画の形成、変形過程の精密な解析を行った（成果は未発表）。まず、小脳のPcdh10発現区画の発達を、whole mount標本および連続切片を用いて、胎仔期から成獣まで追跡した。胎生13.5 日において、約4個の集団が認識され、日齢が経過すると位置と形を変えていく状況が追跡された。そして、成獣小脳におけるPcdh10発現区画を、成獣小脳の機能区分の標準的マーカー分子であるAldocの発現パタンと比較して、Pcdh10発現区画が既知のどの小脳区分に属するかを明らかにした。これらの結果により、ASD関連小脳部位の特異性を、ASD発症に関係する発達の過程においてさらに検討することが可能となった。
さらに、小脳の第VI-VII小葉の構築それ自体に関して大きな進捗があった。すなわち、ヒト小脳の半球部の大半を占め、非運動機能やASDと関連する領域である第I脚、および第II脚が、両者を併せて齧歯類の第I脚と相同であるという、新しい知見の根拠が得られた。この結果は、疾患モデルマウス・ラットにおける小脳機能の解釈に新たな可能性を与えるものである。これに関して論文発表を準備中である。
また、平行して、第VI-VII小葉を含む小脳の区画構造に関する比較解剖学的解析を行い、成果を発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の中心的部分は、研究代表者・研究分担者と、その指導を受けている1名の大学院生により行われているOL-KOマウスでの解析である。いくつかの技術的な改善を行ったことが、進捗の原因である。OL-KOマウスは、実際に繁殖を始めてみると、オス・メスとも交配しにくく、さらにメスは子育てをしないという、非常に繁殖が困難な系統であった。元々C57BL/6Nマウスの系統をバックグラウンドとしていたが、C3H系統のオスと交配させて、交雑系統であるB6C3F1マウスをバックグラウンドとしたところ、ヘテロのオスが比較的順調に交配して、系統の維持や、胎仔や新生仔の採取がよくできるようになった。また、胎仔の脳の切片は非常に脆弱であるが、ミクロトームで切片を作製後、まず、直接スライドグラスに貼り付け、そのあとで、ベータガラクトシダーゼの発色反応をおこなうという方法を採用して、切片の破損を最低限にすることができた。
また、小脳の第VI-VII小葉の特異性に関する解析で、ヒト、サルの第I脚、および第II脚が、両者を併せてマウスの第I脚と相同である可能性に、偶然に気がついたことが進展のきっかけになった。これは、研究代表者と研究分担者がかつてサル（マーモセット）をもちいて、小脳全体の小葉構造と分子発現パタンの綿密な解析を行って三次元モデルを作成していたことが非常に寄与している。
また、研究分担者が平行して行っている、小脳の神経投射や、プルキンエ細胞集団に関する、関連した解析が、共同研究者との共同研究や、研究室内の他の大学院生の研究によって進展したことも本研究に寄与している。本研究の費用により蛍光顕微鏡が整備されたことも進捗の理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度の平成27年度は、平成26年度からのOL-KOマウスを用いた小脳のPcdh10発現区画の形成過程の解析を完成させる。すなわち、E13.5から成獣まで、PC集団の作る区画が形成され発達していく様子を詳細に解析する。これまでにほぼ完成した、各日齢での小脳標本の連続切片作製、区画特異的に発現しているマーカー分子の写真撮影、コンピュータ上での区画の三次元的再構築という手法を用いる。胎児期、新生仔期での解析は、Pcdh10、Pcp2、Foxp2、Rora、Epha4といった、これまでにE17.5で小脳縦縞区画のマーカー分子として有用なことが確認された分子に関しての免疫染色からの解析も追加する。これらから第VI-VII小葉の特異性に関して、形成過程から理解することを試みる。
さらに、平成27年度は、第VI-VII小葉の特異性に関して、入出力神経投射の解析もすすめることが、当初からの計画である。平成26年度に研究代表者らが論文発表したAldoc-Venusマウスを用い（小脳の縦縞区画構造が蛍光標識されているマウス）、蛍光顕微鏡下にPcdh10発現部位に対応した小脳皮質の部位、そして、そこと連絡する小脳核内の部位へ神経トレーサー（蛍光標識デキストラン、蛍光標識ラテックスビーズ等）を注入し、小脳入出力線維を標識する。これにより、第VI-VII小葉あるいは、第I脚の神経回路の特異性を明らかにし、この部位が非運動機能またはADS関連機能に関わる基盤を探ることをめざす。トレーサーとして、従来から用いているデキストランアミン以外に、いくつかの利点のある、アデノ随伴ウイルスベクターのトレーサーを導入することも考慮する。
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| Causes of Carryover |
僅少の残額1342円が残ったが、研究には差しつかえなかったのでそのままとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費の一部として使用する。
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[Journal Article] Systematic regional variations in Purkinje cell spiking patterns2014
Author(s)
Xiao J, Cerminara NL, Kotsurovskyy Y, Aoki H, Burroughs A, Wise AK, Luo Y, Marshall SP, Sugihara I, Apps R, Lang EJ
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 9(8)
Pages: e105633
DOI
Peer Reviewed
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