筋強直性ジストロフィーにおけるCTGリピート不安定性の病態研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26430053
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 櫻井 英俊 京都大学, iPS細胞研究所, 講師 (80528745)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 疾患特異的iPS細胞 / 筋強直性ジストロフィー / CTGリピート

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、筋強直性ジストロフィー(DM1)患者3例からのiPS細胞各2クローン、計6クローンについて、継代維持培養、神経細胞、骨格筋細胞および心筋細胞への分化誘導培養を実施し、3段階の異なる継代数でそれぞれのゲノムDNAを回収し、精度の高いSmall pool PCR法（Sp-PCR法）にてCTGリピート数を解析した。
まず継代維持培養時においては、すべてのクローンにおいて、約10継代ごとの継代数の増加とともにCTGリピート数のピーク値が増大する傾向が認められた。次に特定組織への分化誘導時については、元の未分化細胞と比較して、ほとんどCTGリピート数には変化がない事が明らかとなった。これは神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞のどの系譜においても同様であった。また継代数が増えれば、分化細胞でのCTGリピート数は増大する傾向が、未分化細胞と同様に認められた。以上の結果から、CTGリピート数の増大を決定づける因子は、特定組織への分化ではなく、細胞の増殖過程であることが強く示唆される。
次に、網羅的遺伝子発現解析に移行する前の段階として、患者由来iPS細胞から分化させた組織細胞において、RNAのスプライシング異常が本当に起こっているかどうかを確認するため、既報で報告されているいくつかの遺伝子について、そのRNAスプライシングパターンをPCRにて健常iPS細胞由来組織と比較した。いくつかの遺伝子において、患者で報告されているのと同様のスプライシング以上を検出することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画ではH26年度中にCTGリピート伸長の解析を行うとしており、Sp-PCR法での解析は非常に難易度が高く何度も再実験を行いながら、予定通り本年度中に6クローンすべてのゲノムDNAの解析を終えることができた。またその解析を通して、これまで報告されていたような組織間でのCTGリピート数の相違については、この実験系では検出されず、継代培養による細胞増殖が、最もCTGリピート数の増大に寄与していることが示唆された。この結果は今後のメカニズム解析を行う上で、未分化細胞の継代培養中の変化を中心に解析知ればよいことが分かり、非常に有用な情報となった。またDM1の病態には必須であるRNAのスプライシング異常が、確かに我々の実験系で再現されていることが明らかとなり、予定通りの計画の実施を推進するデータとなった。

Strategy for Future Research Activity

本年度の成果により、CTGリピートの不安定性を解析するためには、未分化iPS細胞の継代培養時の変化をとらえることが重要であることが分かった。それゆえ、継代数の異なる未分化iPS細胞のRNAseq解析を進める。またエピゲノムの変化をとらえる方法として、計画書の段階ではCHIP-seqにてヒストン修飾を解析する予定であったが、未分化iPS細胞においてはヒストン修飾がアンビバレントな状態という特殊な状態で存在するものも多く、解析が困難であることも予想される。そこで代替案として、高次クロマチンの構造がヘテロクロマチンであるのかユークロマチンであるのかを解析するATAC-seqという研究手法を用いて、リピート伸長の原因候補遺伝子のRNAが転写されやすい状態にあるのかどうかを解析することも検討する。