アルツハイマー病：食物由来のアミロイド-β蛋白抑制物質の併用療法と環境療法の探索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26430058
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 森 隆 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (60239605)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 神経病理学 / アルツハイマー病 / アミロイドβ蛋白 / 遺伝子改変マウス / フェノール化合物

Outline of Annual Research Achievements

これまでに有効性を明らかにしてきた食物由来フェノール化合物のコンビネーション投与による認知機能障害の改善・軽減効果への相乗効果の研究を行った。即ち、１）Aβ蛋白産生系を抑制する化合物である ferulic acid（β-secretase modulator）そして２）非Aβ蛋白産生系を亢進する化合物 octyl gallate（α-secretase modulator）を組み合わせた併用投与を行った。PSAPP マウスに、12 ヵ月齢から 3 ヵ月間（15 ヵ月齢まで）、胃ゾンデを用いて 0.2 mL（総投与量）/mouse（20-30 mg/kg）を 24 時間毎に経口投与して、その効果を単独投与群そして対照群と比較検討した。また、wild-type littermateマウスにも同様の投与を行い比較検討した。その結果、これらの化合物を併用投与すると、病態モデルマウスである PSAPP　マウスで観察される過活動、物体認識障害、空間認知機能障害などの行動学的障害が単独投与群よりも有意に改善し、相乗効果が得られた。また、単独投与群でも対照投与群と比較してこれらの行動学的障害が有意に改善し、同様の投与を行った wild-type littermate マウス群と有意差がないレベルに改善した。これら化合物の投与は、正常マウスの認知機能亢進には影響しなかった。即ち、アルツハイマー病の治療にさらに有効となり得る研究データを集積できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成 26 年度は、PSAPP マウスそして wild-type littermate への 12 ヵ月齢から 3 ヵ月間（15 ヵ月齢まで）の胃ゾンデを用いた24時間毎の各群マウスへの経口投与を完了した。また、投与開始時点そして 3 ヵ月間の投与後に、行動学的解析を行い、単独投与群そして対照群と比較検討した。行動学的解析は、Y-迷路試験、新規物体認識試験、放射状水迷路試験を実施した。これらの化合物を併用投与すると、病態モデルマウスである 　PSAPP マウスで観察される過活動、物体認識障害、空間認知機能障害などの行動学的障害が単独投与群よりも有意に改善し、相乗効果を示す結果が得られた。また、単独投与群でも対照投与群と比較してこれらの行動学的障害が有意に改善し、同様の投与を行った wild-type littermate マウス群と有意差がないレベルに改善する結果が得られた。これら化合物の投与は、正常マウスの認知機能亢進には影響しなかった。以上の様に、予定していた各投与群のマウスにおける行動学的解析を完了できた。

Strategy for Future Research Activity

平成 27 年度は、各群マウスから摘出された脳を用いて、病理組織学的そして生化学的解析を実施する予定でいる。
具体的には、Aβ蛋白量測定・蛋白解析を実施する。具体的には、各実験群の大脳ホモジェネートの TBS、2%-SDS、グアニジン可溶性分画別に、Aβ1－40/1－42 蛋白量を、2%-SDS 可溶性分画のオリゴマータイプの Aβ蛋白量を、ELISA 法にて測定・解析する予定でいる。APP からα-, β-, γ-secretase の酵素的作用にて切断される断片の内、非 Aβ蛋白産生系の亢進指標（α-CTF/sAPPα）と Aβ蛋白産生系の亢進指標（β-CTF/sAPPβ）を、Western blot 法あるいは ELISA 法で測定・解析する予定でいる。さらに、神経病理組織学的評価を行う。具体的には、各実験群の後頭部大脳において、5 レベル（150μm 間隔）でパラフィン標本を作製し、免疫組織化学的染色（4G8, GFAP, Iba1抗体）を行い以下の項目を評価する。脳内の空間的 Aβ蛋白沈着 [斑数（長径を三分類：< 25, 25-50, 50 μm <）、占有率]、神経細胞脱落、グリア細胞占有率を大脳皮質・海馬で、画像解析ソフトにて定量的に解析する。オリゴマータイプの Aβ蛋白への効果を、免疫組織化学的染色（OG 抗体）を行い評価する。最後に、in vitro 解析を行う予定でいる。具体的には、CHO/APPwt 細胞（ヒト wild-type APP 遺伝子を発現させた Chinese hamster ovary 細胞）を用いて、in vitro 実験を行う。各薬剤を単独あるいは組み合わせて、各種濃度で併用添加し、有効性（相乗効果）を比較検討する予定でいる。Aβ1－40/1－40 蛋白量を、ELISA 法で測定・解析する予定でいる。APPからα-, β-, γ-secretase の酵素的作用にて切断される断片の内、非Aβ蛋白産生系の亢進指標（α-CTF/sAPPα）と Aβ蛋白産生系の亢進指標（β-CTF/sAPPβ）を、Western blot 法 あるいは ELISA 法で測定・解析する予定でいる。

Causes of Carryover

残高が少なくなり、目的の試薬を購入するあたり十分な額でなかったため、次年度と合算して使用する必要があった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度予算と合算して、免疫染色用の試薬購入に当てる予定でいる。