2015 Fiscal Year Research-status Report
神経筋発生およびシナプス形成における膜結合型コラーゲンCLAC-Pの機能の解明
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26430064
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
若林 朋子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20530330)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CLAC-P/collagen XXVとRPTPとの結合および機能的関連について、HEK293細胞とリコンビナントsCLACを用いた結合アッセイを行った。RPTPσ, δの各種バリアントを発現させた細胞にのみ、sCLACの結合が認められた。またRPTPのドメイン欠損変異体を用いた検討では、CLAC-PがIg-like domainを介してRPTPに結合する可能性を示唆するデータを得た。次に、昨年度確立したマウス胎児脊髄前角のexplantとHEK293との共培養実験を用い、CLAC-Pの細胞外領域切断が生じない変異体を発現する細胞では、運動ニューロンの軸索誘因効果が顕著に低下することを見出し、furinによる切断の機能的重要性を明らかにした。またexplant共培養実験へのRPTPσ細胞外領域の添加により、CLAC-P依存的な軸索誘因・集積が競合的に阻害され、CLAC-Pによる軸索集積効果にRPTPが関与している可能性を示した。
CLAC-Pのシナプスにおける機能を探索する目的で、昨年度より作出を行ってきたNestin-Cre;Col25a1 floxマウスの解析を行ったが、成体の脳において顕著な変化は認められなかった。またsCLAC-Fcをコートしたビーズを初代培養神経細胞に撒きこみ、相互作用分子の探索を行った。クロスリンク後にsCLAC-Fcを濃縮し、酵素消化したペプチド断片をMS解析に供した。その結果、8つの結合候補分子が見出された。しかし、HEK293細胞へのCLAC-Pとの共発現による免疫共沈降実験では、いずれの候補分子でも有意な結合は認められなかった。
組織特異的CLAC-P発現マウスの作製にあたり、タグ付加の条件を検討した。カルボキシ末端へのタグ付加に加え、新たにfurin切断部位直後へタグ付加したCLAC-Pを作製し、複数のタグで正常に分泌されることが確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は①RPTPσ, δとの結合の解析、②CLAC-P結合分子のプロテオミック解析、③inducible Tgマウス作製、を進めた。このうち①については、複数の実験系を用いて相互作用を示し、かつCLAC-Pの切断の重要性やRPTPの結合部位の絞り込みなど、機能制御に関連する結果を得た。②に関しては、一連の解析ならびに特異性の確認を完遂した。③について、現在トランスジーンのタグ挿入に関するデザインの最適化を行っており、平成28年度初頭には動物の作製にとりかかる予定である。また、CLAC-Pの運動ニューロン発生における役割を解明する目的で薬剤誘導性Col25a1 KOマウスの作製も予定していた。このマウスについては、Col25a1 floxマウスとROSA-CreERTマウスの交配を進めており、tamoxifen誘導の条件検討を開始できる段階にある。以上の理由から、交付申請時の研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの進捗を受け、平成28年度には既に確立した複数のin vitro実験系を用いて、RPTPとCLAC-Pとの相互作用メカニズムのより詳細な解析を進める。具体的には、両者の結合領域の同定、グリコサミノグリカンによる相互作用の制御の可能性の検討などを行う。
また、タグ付加の条件が決定次第、CLAC-Pの組織特異的 Tgマウスの作出を行う。また、薬剤誘導性Col25a1 KOマウスを用い、胎生期におけるKOが神経筋接合部形成や骨格筋の成熟に及ぼす影響を解析する。また成体におけるKOも行い、これまでに確立した筋傷害モデルにおいてCLAC-Pの欠損が再生に及ぼす影響を検討する。
更に、神経特異的なCLAC-Pの欠損がマウスの生存ならびに脳の発生に重大な影響を及ぼさない事が確認されたことから、このモデルを用いた網膜RGC細胞におけるCLAC-Pの役割の検討も開始する。
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