情動記憶における核ーシナプス間情報伝達を担う分子の探索

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26430076
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 児島 伸彦 東洋大学, 生命科学部, 教授 (80215251)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 遠藤 昌吾 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター, 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究部長 (60192514)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: CRE転写調節 / 最初期遺伝子 / 海馬ニューロン / 樹状突起スパイン / PC12細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、転写調節因子ICERの情動記憶の固定化の調節メカニズムを明らかにすることを目的として、その標的遺伝子をゲノムワイドに検索し同定し、記憶素子としての樹状突起スパインの構造可塑性との関連を調べる。これにより核―樹状突起スパイン間の情報伝達のしくみを明らかにするというものである。27年度は、海馬の初代培養ニューロンへのICER過剰発現が細胞形態およびシナプス形態に及ぼす影響を調べた。また、PC12細胞をモデル系としてICERの恒常的過剰発現がタンパク質組成にどのような変化をもたらすかについて調べた。まず、マウス海馬初代培養ニューロンに、Mycタグで標識したICER（Myc-ICER）をトランスフェクションにより一過性に過剰発現させたニューロンの樹状突起の分枝を計測したところ、対照ニューロンと比較して、樹状突起本数が有意に減少していた。このことと昨年度、樹状突起スパイン数がICER過剰発現で有意に減少するとの結果を合わせると、ICERがニューロンの樹状突起分岐やスパイン数に抑制的に制御している可能性が考えられる。また、ドレブリンの免疫陽性スパイン数もICER過剰発現ニューロンで有意に減少するという昨年度の結果を定量的に再確認することができた。ICERの下流遺伝子を同定することを目的に、ICERを恒常的に過剰発現するPC12細胞と通常のPC12細胞とで、タンパク質組成の違いを二次元電気泳動法により検出する試みを行った結果、pI9-10付近の一群の塩基性タンパク質がICERの過剰発現で減少していることが確認された。これらあるいはこれらの代謝に関わるタンパク質がICERによって発現抑制されている可能性がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初計画していた以下の実施が諸事情によりできなかった。
(1) 抗ICER特異抗体を用いたクロマチン免疫沈降の至適条件を決定する。
ICERを恒常的に発現するPC12細胞を用いて、ホルムアルデヒドによりタンパク質とクロスリンクしたDNA（クロマチン）を酵素処理することにより断片化を試みたが、実験例に示されているような150-900 bpの範囲でのラダー状断片とはならず、150 bpを中心としたスメア状断片となった。これは酵素処理あるいはその後の超音波破砕の条件が厳しすぎたことにより、DNAが壊れてしまったものと考えられた。そのため、27年度は次の抗体による免疫沈降のステップに進むことを断念した。
(2) 恐怖条件づけしたICER過剰発現マウスの海馬で抗ICER特異抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行い、ICERの結合する下流遺伝子を同定する。
ICER過剰発現マウスは共同研究者（健康長寿医療センター）の所属機関にて保管されているが、ほとんどは凍結卵の状態で保管されており、それを仮親に戻して生きた個体を得る必要があるため、実験に使用できるだけの匹数を確保することができず、27年度は使用できなかった。

Strategy for Future Research Activity

まず、27年度に得られた研究結果について、以下のとおり、さらに検討を進める。
(1) ICERの強制発現による海馬ニューロン樹状突起スパインの形態に及ぼす影響については、28年度所属施設に導入するThy1-GFPトランスジェニックマウスの海馬ニューロンを用いて、Myc-ICERのトランスフェクションによる形態変化を経時的に観察する。また、ドレブリンをはじめスパイン内に局在する分子の分布を免疫細胞染色でみることにより、形態変化との関連を調べる。
(2) ICERの恒常的発現PC12細胞において見出された発現減少する一群の塩基性タンパク質を二次元電気泳動ゲルより単離、精製し質量分析により同定する。
(3) その他のICERの標的遺伝子を網羅的に探索するためには、クロマチン免疫沈降法（ChIP）が有効であるので、クロマチン断片化について、ヌクレアーゼ処理および超音波処理の最適化を ICERの恒常的発現PC12細胞およびICER過剰発現マウス脳サンプルを用いて再度試みる。定常状態で、過剰発現したICERが結合するDNA断片を単離し、これを次世代シークエンサー（共同研究者の研究機関のものを使用）により配列決定する。
(4) (3) の研究がうまくいかない場合には、ICERを過剰発現する細胞よりRNAを単離し、cDNAに転換後、対照細胞のcDNAとの間でサブトラクションを行い、差分により選別されたcDNAの配列決定を行うことで、ICERの標的遺伝子の同定を試みる。

Causes of Carryover

当初計画していた以下の実施が諸事情によりできなかったことによる。
(1) 抗ICER特異抗体を用いたクロマチン免疫沈降を実施できず、予定していたそれ以降の実験（DNA配列決定など）費用が生じなかったため。
(2) ICER過剰発現マウスの実験に必要な匹数を揃えられず、使用できなかったことにより、動物行動実験の費用が生じなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度中に、27年度実施できなかった実験計画も含めて、新たに計画を立て直して研究を実施する。