脳発達期におけるミクログリアのFcγ受容体を介したシナプス形成制御の可能性

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26430081
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 大内田 理佳 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (80391887)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ミクログリア / 貪食 / IgG抗体 / IgG抗体の受容体

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、（１）FcγRIおよびSykのミクログリア特異的な遺伝子欠損マウス、または抗体が存在しない免疫不全マウスを用いて、FcγRI―ITAM―Sykによるシグナル伝達経路の破綻が、脳発達期における神経細胞によるアポトーシス除去や、変性シナプスの貪食除去を介したシナプス形成に与える影響をin vivoで検討する。各遺伝子欠損マウスの胎生期から生後初期にかけての経時的な脳組織切片を用いて、アポトーシスおよびシナプス形成を可視化し野生型と比較検討する。また、（２）初代培養ミクログリアを用いて、IgG抗体、Syk阻害剤またはFc阻害剤がミクログリアの貪食活性に与える影響をin vitroで検討する。最後に、（３）Fcγ受容体経路と補体経路との相互作用の有無を、FcγRI欠損マウスおよび補体成分C1q、C3または補体受容体CR3の遺伝子欠損マウスをそれぞれ掛け合わせた二重欠損マウスを作出し（１）と同様にin vivoで検証する。本研究は、大きく６つのステップに分けて進める。平成２６年度では、本研究を開始する動機として重要となる、脳発達期のミクログリアにおけるFcγ受容体の発現量を解析し、胎児脳内における母体由来のIgG抗体の有無を確認する（Step1および2）。また、ミクログリア特異的なFcγRIおよびSykの遺伝子欠損マウス作出の準備をする（Step3）。平成２７年度より、得られた遺伝子欠損マウスを用いて、FcγRIおよびその下流のシグナル経路が破綻した際のミクログリアによる貪食活性をin vitroおよびin vivoで解析し、シナプスを可視化してシナプス形成に与える影響を検討する（Step4および5）。また、これまでにシナプス刈り込みへの関与が示唆されている補体経路との相互作用を、二重欠損マウスを作出してStep4および5と同様に解析する（Step6）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

はじめに、野生型マウスを用いて、ミクログリア上のFcγRの発現をFACSで検出する系を確立した。ミクログリアの表面マーカーであるCD11bおよびCD45の両陽性細胞に着目し、FcγRIおよびFcγRII&IIIをそれぞれ染色した。胎生初期（E9.5）から出生後にかけての経時的な変化を観察したところ、胎生10日頃にミクログリア上でのFcγRの発現量が最も高く、その後徐々に減少することが判明した。一方、脳内におけるIgG抗体をELISA法で検討した。この解析では、脳内における血流からのIgG抗体のコンタミネーションを防ぐために、予めPBSバッファーで心臓還流し血液を除去した。その後、脳細胞懸濁液を調整しタンパク質を抽出してIgG量を測定したところ、心臓還流を施すことができた最も初期の胎生15日におけるIgG量が最も高く、その後減少し、出生後ではほとんど検出できなかった。以上の結果から、胎生期のミクログリア上に高発現するFcγRに、脳内に流入した母体由来IgG抗体が結合し、ミクログリアの活性化を誘導して脳機能構築に関わる可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

平成２７年度では、野生型マウスまたはFcγRI欠損マウスより調整した初代培養ミクログリアを用いて、in vitroにおけるミクログリアの貪食活性を検討する。一方、in vivoにおける貪食活性を検討するために、それらの遺伝子欠損マウスに加え、抗体不全マウス（NSG）を用いて、胎生期に生じるアポトーシスの貪食除去に与える影響を、TUNEL法を用いた神経細胞のアポトーシス量で評価する。また、in vivoにおけるシナプス形成を検討するため、アレイ断層撮影（Neuron 55:25-36, 2007）を用いて、シナプス構造を可視化し判定する。まずは、アレイ断層撮影法の技術習得から開始する。さらに、補体経路との相互作用を検証するために、補体成分または補体受容体の欠損マウスの導入を開始する。