2014 Fiscal Year Research-status Report
インスリン分泌不全型糖尿病モデルラットを用いて脂肪蓄積遺伝子を同定する
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26430101
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| Research Institution | Research Institute, International Medical Center of Japan |
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Principal Investigator |
岡村 匡史 独立行政法人国立国際医療研究センター, その他部局等, その他 (00333790)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | LEAラット / 肥満 / 次世代シークエンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インスリン分泌不全型糖尿病モデルであるLEAラットは､先天的なインスリン分泌不全に加え、腎尿細管上皮細胞が特異的に変性するため、腎性糖尿を発症する。さらに、コンジェニック系統を用いた解析から、LEAラットの第10染色体に腹腔内脂肪蓄積をコントロールする抗肥満遺伝子の存在が示唆されている。本研究の目的は、LEAラットに存在する抗肥満遺伝子を同定することである。
第10染色体には、LEAラットの腎性糖尿の原因遺伝子であるシスチノシン（Ctns）遺伝子が存在し、CTNS遺伝子が原因遺伝子として報告されているシスチノーシス患者では、成長遅延が見られるため、Ctns遺伝子変異が抗肥満の原因であることが考えられた。その可能性を排除するため、正常なCtns遺伝子を含むBNラットのD10rat241-Ctns(0.1Mb)をLEAラットに導入したサブコンジェニックラット（LB-Ctns(+/+)-S1）を作成し、表現型解析を行った。その結果、LB-Ctns(+/+)-S1の体重と腹腔内脂肪量は10、20、30週齢共に、BNラットのD10rat34からD10rat243を導入したコンジェニックラット（LB-Ctns(+/+)-L1）と比べて有意に低い値を示し、LEAラットと同等であった。Ctns遺伝子が正常であるLB-Ctns(+/+)-S1系統がLEAラットと同様の体重および腹腔内脂肪量を示したことから抗肥満遺伝子はD10rat241-Ctns間には存在せず、この領域を除いたD10rat34からD10rat243（30.94Mb, 451遺伝子）に存在することが明らかになった。さらに、抗肥満遺伝子はCtns遺伝子ではないことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LEAラットのCtns遺伝子変異を同定する過程で作成したコンジェニックラット（LEA-BN(D10rat34-D10rat243 ; LB-Ctns(+/+))は、LEAラットに比べ体重が有意に増加し、特に腹腔内脂肪が顕著に蓄積していた。従って、D10rat34からD10rat243間の36.8Mbに肥満関連遺伝子が存在することが明らかであるため、平成26年度はこの領域に存在する478遺伝子のタンパク質コード領域を網羅するようにPCRプライマーを設計し、次世代シークエンサーで塩基配列を解読する計画であった。しかしながら、この領域にはCtns遺伝子も含まれており、LEAラットではCtns遺伝子に13塩基の欠損があることを報告している。
ヒトにおいて、CTNS遺伝子を欠損すると腎尿細管障害と共に、成長遅延を呈することが報告されており、LEAラットにおいて、Ctns遺伝子変異が体重減少を起こしている可能性を排除することができなかった。LEAラットの抗肥満遺伝子がCtns遺伝子かどうかは本研究計画において、非常に重要な分岐点となるため、正常なCtns遺伝子を含むBNラットのD10rat241-Ctns(0.1Mb)をLEAラットに導入したサブコンジェニック系統（LB-Ctns(+/+)-S1）の解析を優先した。その結果、抗肥満遺伝子はCtns遺伝子ではなく、D10rat34からD10rat243（30.94Mb, 451遺伝子）に存在することが明らかとなった。当初予定していた478遺伝子の塩基配列の解読は、次年度に繰り越したものの、次年度に予定していたサブコンジェニック系統（LB-Ctns(+/+)-S1）の表現型解析を前倒しで行ったため、研究計画は概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までの研究で明らかとなった候補領域D10rat34-D10rat243（30.94Mb）には、451遺伝子が存在し、タンパク質コード領域の塩基配列の総和は約1Mbである。全てを網羅するように10-15kbを増幅するPCRプライマーを約100セット設計し、ロングPCRにより増幅する。増幅したゲノム断片を全て混ぜて、ライブラリを作製し、デスクトップ型次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解読する。さらに、同定したCRISPR/Casシステムを用いて候補遺伝子変異をマウスに導入し、経時的に実験動物用X線CT装置を用いて腹腔内脂肪量を測定し、遺伝子変異と腹腔内脂肪量との相関から原因遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
サブコンジェニック系統の解析を前倒しで行い、次世代シークエンサーを用いた478遺伝子の解読を次年度に繰り越したため、約80万円を次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
候補領域には451遺伝子が存在し、タンパク質コード領域の塩基配列の総和は約1Mbである。全てを網羅するように10-15kbを増幅するPCRプライマーを約100セット設計し、ロングPCRにより増幅する。増幅したゲノム断片を全て混ぜて、ライブラリを作製しデスクトップ型次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解読する経費として使用する。
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