2014 Fiscal Year Research-status Report
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26430134
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Research Institution | National Cancer Center Japan |
Principal Investigator |
落合 雅子 独立行政法人国立がん研究センター, その他部局等, 研究員 (90150200)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
筆宝 義隆 独立行政法人国立がん研究センター, その他部局等, 客員研究員 (30359632)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 正常肺3D培養 / in vitro肺発がんモデル |
Outline of Annual Research Achievements |
正常小腸3次元(3D)培養細胞においては、「in vitro発がん再構成」の手法を既に確立していたが、肝臓組織より樹立した胆管細胞(肝内胆管由来)においても、3D培養が可能であり、レンチウィルスによる遺伝子導入と組み合わせた「in vitro発がん再構成」を確認した。様々な臓器で、3D培養細胞を用いた「in vitro発がん再構成」が可能と考えられた。 正常肺3D培養細胞を用いた遺伝的再構成によるin vitro肺発がんモデルの構築のために、まず、多様な細胞種の培養を可能にする培養条件を検討した。EGF添加無血清培地に、あるシグナル伝達関連因子の阻害物質である低分子化合物Xを添加して培養し、遺伝的再構成を行った後に、ヌードマウス皮下での腫瘍形成能を解析した。Kras変異(LSL-KrasG12D)マウス由来の正常肺3D培養細胞を、Cre recombinaseを導入してKrasを活性化させた後に、がん抑制遺伝子のshRNA (shGeneA)を導入すると腫瘍が形成された。更に、低分子化合物Xの種々な濃度、及びII型肺胞上皮細胞の誘導が報告されている成長因子Yの有無で培養し、3D培養細胞の形態の組織学的解析から、条件検討を行った。成長因子Yの添加により、細胞増殖が昂進すると共に、II型肺胞上皮細胞のマーカーが陽性の細胞数が増加したので、成長因子Yは添加して培養することにした。現在、低分子化合物Xの有無の2条件で、遺伝的再構成(陰性コントロール、Krasの活性化のみ、Krasの活性化+shGeneAの3パターン)を行い、ヌードマウス皮下での腫瘍形成能の獲得を検討中である。平成27年度に、まず、この2条件で形成されるヌードマウス皮下腫瘍を組織学的に解析し、培養条件を確定する。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1年目は、多様な細胞種の培養を可能にする培養条件を検討した過程までだったので、「少し遅れている」とした。それは、肺組織中の気道上皮細胞のみならず、多様な細胞種の培養は、特に肺腺がんを誘発するモデルの構築には必要不可欠と考え、詳細に検討したためである。正常肺組織の3D培養の条件の確立は、これ以降の実験の基本となるものであり、非常に重要である。平成26年度の段階で、ほぼ2条件に絞り込み、現在、遺伝的再構成によるヌードマウスでの皮下腫瘍形成能の解析中であり、その解析結果から、培養条件を確定し、以降の実験を行う予定である。
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Strategy for Future Research Activity |
平成27年度の早期に、肺3D培養の方法を確立する予定である。以後、下記の解析を行う。 1.他の組み合わせでの遺伝的再構成による発がんの解析:Kras変異マウス由来の正常3D肺細胞を用いた、Kras変異と協調的に発がんを促進するshGeneA以外の組み合わせを検討する。また、B6マウス由来肺細胞を用いたKras変異以外の遺伝子との組み合わせによる発がんも検討する。 2.ヌードマウスでの皮下腫瘍形成能を推定可能なin vitroマーカーの開発:まず、in vitroマーカーとして、spheroid形成能に着目する。肺3D培養細胞に、個々のshRNAの組み合わせで遺伝的再構成を行い、spheroid形成能と皮下腫瘍形成能の相関関係を検討する。 3.In vitro肺発がんモデルを用いた肺発がんの分子機構の解明:まず、肺がん関連遺伝子候補の肺発がんへの影響を解析する。GWASやゲノミクス解析で抽出された肺がん関連の候補遺伝子に関して、in vitro肺発がんモデルで遺伝的再構成を行い、肺発がんへの影響を検討する。 4.化学物質の肺発がん性のin vitro評価系への応用:in vitro肺発がんモデルに化学物質の暴露を組み合わせ、肺発がん性のin vitro評価系を構築する。動物個体を用いた発がん実験で、肺発がん性が確認されている物質で、まず、検討する。
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Research Products
(2 results)