2015 Fiscal Year Research-status Report
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26430145
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| Research Institution | Tohoku Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
藤村 務 東北薬科大学, 薬学部, 教授 (70245778)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 前立腺がん / 診断マーカー / IgGの糖鎖 / 糖鎖修飾ペプチド抗体 / anti Hpt抗体 / anti IgG抗体 / ELISA / Luminexビーズ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「目的」：前立腺がんの診断には前立腺特異抗原（PSA 値）が用いられているが、グレーゾーンといわれる検出範囲、4-10 ng/ml には良性疾患患者が7 割も含まれ、不必要な針生検が行われているのが現状である。これまで申請者は前立腺がん患者血清ハプトグロビン(Hpt)からがん特異的な糖鎖修飾ペプチド抗体を作製し、ELISA 法の開発を行ってきた。今回新たに、前立腺がん患者血清IgGの糖鎖構造変化を見出した。糖鎖修飾を標的としたHpt とIgG による多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体検出法を開発し、針生検を必要としない高感度、高精度な確定診断法を確立し臨床導入を目指す。患者への身体的負担と医療経済的負担の軽減を図る。
「研究実施計画」：スクリーニングとして前立腺がん患者、良性疾患患者、健常者の血清を用いてウエスタンブロットを行い、それぞれの血清IgGに対する反応性の違いからがん患者由来の糖鎖修飾ペプチドG0F、G1F、G2F抗体の特異性の評価を行った。既に作成したanti Hpt抗体とanti IgG抗体を組み合わせることにより、健常者とグレーゾーン（4-10 ng/ml）値を示すがん患者の診断区別の可能性を示した。作製した抗体を用いてELISA法が構築できるか検討中である。前立腺がんの針生検を必要としない確定診断法の確立を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「糖鎖修飾ペプチドの精製」悪性前立腺がん患者、良性疾患患者、健常者由来の血清中からProtein Gカラムを用いてIgGを精製、トリプシン消化後、悪性前立腺がん患者由来血清IgGの糖鎖修飾ペプチドを精製した。
「糖鎖修飾ペプチド抗体の作製」悪性前立腺がん患者由来血清からIgG由来の糖鎖修飾ペプチドG0F、G1F、G2Fから糖鎖修飾ペプチド抗体を作製した。抗体の特異性をウエスタンブロット法で確認した。
「スクリーニング」スクリーニングとして前立腺がん患者、良性疾患患者、健常者の血清を用いてウエスタンブロットを行い、それぞれの血清IgGに対する反応性の違いからがん患者由来の糖鎖修飾ペプチドG0F、G1F、G2F抗体の特異性の評価を行った。
anti Hpt抗体とanti IgG抗体を組み合わせることにより、健常者とグレーゾーン（4-10 ng/ml）値を示すがん患者の診断区別の可能性を示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
スクリーニングとして前立腺がん患者、良性疾患患者、健常者の血清を用いてELISA法を行い、それぞれの血清IgGに対する反応性の違いからがん患者由来の糖鎖修飾ペプチドG0F、G1F、G2F抗体の特異性の評価を行う。既に作成したanti Hpt抗体とanti IgG抗体を組み合わせることにより、健常者とグレーゾーン（4-10 ng/ml）値を示すがん患者の診断が可能性となるか検討する。更にELISA法を応用し、作製した抗体をLuminexビーズに結合しanti Hpt及びanti IgG抗体ビーズを完成させる。Luminexビーズ（多項目を同時に測定できるビーズ）の利点を生かし最も高感度な抗体結合検出法を構築する。多項目同時測定システム(Luminex®200xPONENT)：Luminexテクノロジーシステムの測定系はフローサイトメーターと同様な原理で、赤色と緑色レーザーをビーズに照射する。赤色のレーザーはタンパク質の識別、緑色のレーザーはタンパク質の2次抗体に照射しその蛍光標識を検出して定量を行う。この2色のレーザーを照射することにより、各ビーズの識別と蛍光標識の蛍光値の情報を得ることができるため、多種のビーズが混在した状態でも検出することができ、多項目の同時測定が可能になっている。従来のELISA法に比べ試料量や測定時間が短縮され低コストであり、スループットの大幅な向上を実現できる。多項目の分析結果を多角的に評価することにより検出感度及び特異性の向上が期待される。
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| Causes of Carryover |
理由）本研究を申請するに当たり計上した研究費については、消耗品を主体とした経費が大部分を占める。当初予定していた ELISA法及びLuminex測定用関連試薬の消耗品代が条件検討の段階であった為、当初計画していた予算より消費する必要が生じなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
（使用計画）今年度はELISA法及びLuminexビーズ法を構築する上で標識試薬や磁気ビーズの最適化、プロトコールの条件検討などELISA法及びLuminex測定用関連試薬の消耗品代がかなり必要なため、27年度未使用分の170万円（コーティングプレート、カップリング試薬、二次抗体、蛍光標識抗体など）を使用する。具体的には、作製した抗体をELISA法及びLuminexビーズに結合させオリジナルなMultiPlex kitの開発を進める。anti Hpt及びanti IgG抗体ビーズを混ぜることにより、複数のGlycopeptide抗体の測定が可能となる。複数項目を測定することにより多変量解析が可能となりがんマーカーとしての精度向上につながる。本研究の目的であるがん特異的な糖鎖修飾抗体の作製と、PSA値を補完する前立腺がんの針生検を必要としない確定診断法の確立を目指す。
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[Presentation] GC/MSによる呼気分析2015
Author(s)
藤村 務
Organizer
第341回ガスクロマトグラフィー研究懇談会
Place of Presentation
北トピア13F飛鳥ホール（東京都北区王子）
Year and Date
2015-12-11 – 2015-12-11
Invited
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