新しい方法による標的mRNA切断を応用した新規抗腫瘍核酸医薬の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26430157
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 成田 美和子 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30281009)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梨本 正之 新潟薬科大学, 健康・自立総合研究機構, 教授 (30228069)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヘプタマーsgRNA / 腫瘍 / tRNase Z

Outline of Annual Research Achievements

tRNAはDNAから転写されるが、転写された直後のtRNA前駆体には、その3’末端に成熟tRNAには見られない伸長配列が存在する。tRNA前駆体3’末端の伸長配列がtRNase Zなどのエンドヌクレアーゼによって除去されることにより成熟tRNAとなる。tRNase Z によるtRNA前駆体の切断に関するメカニズムとその標的mRNA切断、特に腫瘍細胞の増殖に関するタンパクに関連するmRNAへの応用については、分担研究者である梨本正之らのグループによって報告された。
今回の検討の目的は、ヘプタマーsgRNAを用いて腫瘍抗原等のmRNAを阻害する方法が、各種の腫瘍細胞に対する治療法として応用可能であることを明らかにするとともに、sgRNAによるmRNA切断法を効果的に応用できる腫瘍抗原等の分子を選択し、sgRNAの最も効果的な塩基配列を決定することである。
臨床応用に関する検討については、白血病をはじめとする腫瘍細胞の培養系およびマウスゼノグラフトモデルを用いて行っている。数種類の白血病細胞株に対するヘプタマーsgRNAの有効性をin vitroとin vivoで確認することができ、26年、27年度には梨本らが論文報告した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

sgRNAの腫瘍細胞のapoptosis誘導効果は、代表的な造血器腫瘍細胞株である急性前骨髄球性白血病細胞株HL-60、多発性骨髄腫細胞株RPMI8226、慢性骨髄性白血病赤白血病型急性転化細胞株K562において再現性のある抑制効果が認められた。その他の白血病細胞株として数種類試みたところ、他の急性前骨髄球性白血病由来の細胞株においては同様の結果が得られたが、抑制率が一定せず、有効な投与開始時間と暴露時間を確認することとした。各種培養条件を設定し、ターゲット細胞の増殖曲線を確認しながら、各種sgRNAによる抑制効果を確認中である。

Strategy for Future Research Activity

sgRNAの効果を確認するための培養条件は細胞株ごとに異なっており、最も効果的な条件を設定できる細胞株がNB4であることが判明した。標的白血病細胞株とその培養条件をさらに工夫して、各種sgRNAによる腫瘍細胞増殖抑制効果を追求する。複数のsgRNA を用いることによる、相乗効果の有無を検討する。

Causes of Carryover

細胞株培養条件設定を確実に行うため、新たなsgRNAの作成を29年度に行う方針になったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

共同研究者らによってゼノグラフトモデルにおける有効性が確認され、sgRNAによる各種腫瘍細胞の細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導についての検討を、主にin vitiroの系でさらに追求する。
各種の白血病細胞株に網羅的に腫瘍関連抗原や免疫チェックポイント因子関連のsgRNAを新しく開発し、sgRNAを添加培養した白血病細胞の当該遺伝子のmRNA発現の阻害を確認するとともに、フローサイトメトリーを用いて、培養細胞の当該タンパク発現の阻害を確認する。MTTアッセイによる細胞増殖の抑制やAnexin V/7AAD染色した培養細胞をフローサイトメトリーで解析することにより、sgRNAを介したアポトーシスの誘導について検討する。