2015 Fiscal Year Research-status Report
ChIP-Injection法：生体内活性を指標としたエンハンサー同定法の確立
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26430182
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
川村 哲規 埼玉大学, 理工学研究科, 講師 (10466691)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エンハンサー / ヒストン修飾 / ゼブラフィッシュ / スクリーニング / クロマチン免疫沈降法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
発生過程において、時期領域特異的な遺伝子発現はエンハンサーにより制御される。近年、活性化されたエンハンサーには、特異的なヒストン修飾(H3K27ac)が存在することが明らかになり、これを認識する抗体を用いた免疫沈降法と次世代シーケンサーを組み合わせたChIP-Seq法によりエンハンサーが網羅的に同定されている。しかしながら、ChIP-Seq法では、同定されたエンハンサーがどのような活性を有しているのかは不明で、その後、in vivo解析により活性を調べる必要がある。さらに候補断片の数が膨大なため、それぞれの活性を解析することは難しい。そこで、胚への注入が簡便にでき、発生過程を通じて蛍光観察が可能なゼブラフィッシュ胚を用いて、エンハンサー活性を指標とした新たなエンハンサー同定法ChIP-Injection法を確立し、機能解析を行うことを目的とした。脊椎動物の胚発生期に胚の最後端に位置する尾芽をモデルとして、尾芽および尾芽由来の組織に特異的に働くエンハンサーを同定することを試みた。平成26年度までに、切断した尾芽を用いて、H3K27acに対するクロマチン免疫沈降法により得られた断片をEGFPリポーター遺伝子に導入した尾芽エンハンサー・ライブラリーを作製し、幾つかのエンハンサー活性を有する断片を得ていた。平成27年度は、計画に基づきスクリーニングを継続した結果、これまでに107個の候補断片をゼブラフィッシュ胚に導入した結果、39個のエンハンサー候補断片を同定した。さらに、この内の4つについて、トランスジェニック胚を作製し、エンハンサー活性を再現することを明らかにした。また、同定した複数のエンハンサーに関して、同染色体上に存在する遺伝子の発現パターンと類似することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は、当初の計画通りにスクリーニングを継続した結果、これまでに107個のエンハンサー候補断片をゼブラフィッシュ胚に導入し、39個のエンハンサーを同定した。さらに、興味深い活性を示した4つのエンハンサー候補断片について、トランスジェニック魚系統を単離し、スクリーニング時の活性を再現することを確認した。さらに、トランスジェニック魚を用いて、同定したエンハンサーの活性を詳細に解析することが出来た。当初の計画通り、平成27年度は、スクリーニングで得られたエンハンサー断片から、今後詳細に研究を行うエンハンサーの絞りこみが出来たため、概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通りに、スクリーングを継続するとともに、興味深い活性を示したエンハンサーに対して、作製したトランスジェニック魚を用いて、解析を行う。さらに、TALEN, CRISPRによるゲノム編集技術により、変異体の作製、解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
物品費に関して、割安なキャンペーン品を積極的に購入した結果、当初の計画よりも少ない費用で賄えたため、未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後、さらなる追加実験が必要となることが見込まれるため、未使用額を充てることを考えている。
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[Journal Article] Posterior-anterior gradient of zebrafish hes6 expression in the presomitic mesoderm is established by the combinatorial functions of the downstream enhancer and 3'UTR.2016
Author(s)
(14)Kawamura, A., Ovara, H., Ooka, Y., Kinoshita, H., Hoshikawa, M., Nakajo, K., Yokota, D., Fujino, Y., Higashijima, S., Takada, S., Yamasu, K.
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Journal Title
Developmental Biology
Volume: 409
Pages: 543-554
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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