2014 Fiscal Year Research-status Report
マイクロサテライト配列におけるヌクレオソーム形成とそのクロマチン動態
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26430186
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| Research Institution | Meisei University |
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Principal Investigator |
清水 光弘 明星大学, 理工学部, 教授 (80231364)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム機能発現 / ヌクレオソーム / クロマチン / 反復配列DNA / 出芽酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
単純反復配列であるマイクロサテライトはヒトゲノムの約3%をも占めている。ヒトゲノムでのマイクロサテライトの存在頻度は単に塩基配列の出現確率では説明できず、高い頻度で存在する配列がある一方で、ほとんど存在しない配列がある。本研究は、マイクロサテライトのゲノムにおける存在頻度とクロマチン構造との関係を明らかにすることを目的としており、in vivoとin vitroの両面から、マイクロサテライト配列のヌクレオソーム形成を評価し、その安定性と動態を明らかにする。
まず、in vivoでのヌクレオソームの形成を評価するために、従来用いられてきたmicrococcal nuclease (MNase)による限定消化法と、ヌクレオソーム中央を特異的に切断する化学的切断法とを併用したマッピング法を確立した。MNase は塩基配列に選択性があり，MNaseによる限定消化ではしばしばヌクレオソームの位置を決定できないという問題がある。本研究において、化学的切断法と併用することによってヌクレオソームの形成と位置を明確に評価できることが示された。
次に、出芽酵母ミニ染色体を用いて、3塩基対を単位とする10種類のリピート配列を挿入し、in vivoでのヌクレオソーム形成の促進と阻害の効果について系統的に解析した。その結果、ヒトゲノムでほとんど存在しないリピート配列はヌクレオソームを形成しにくいことが示された。現在、4塩基対を単位とするリピート配列についても解析を進めている。
さらに、ATTCTやCTGリピートなど疾患に関連するマイクロサテライトの不安定化に関わる因子を探索するためのアッセイ系として、出芽酵母PHO5をレポーターとしたミニ染色体を構築した。一方で、in vitroで再構成したヌクレオソームの形成と安定性を評価する実験に用いるマイクロサテライトDNA断片の大量精製を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は大学院生1名と卒研生4名とともに、本研究課題に取り組んだ。3塩基対リピート配列の出芽酵母ミニ染色体へのクローニングは計画どおりに構築を終えた。また、ヌクレオソーム形成をin vivoで評価する方法として、出芽酵母の核を試料として化学的切断法によるヌクレオソームマッピングの方法を確立し、従来のMNaseによる限定消化法と併用することによって、ヌクレオソーム形成を明確に評価できるアッセイ系を構築した。また、ATTCTやCTGリピート配列など疾患に関連するマイクロサテライトの不安定化に関わる因子を探索するためのアッセイ系として、出芽酵母PHO5をレポーターとしたミニ染色体を構築した。さらに、in vitro再構成ヌクレオソームの解析に向けてDNA断片の大量調製を進めている。
以上、マイクロサテライト配列を含むミニ染色体の構築を含めた試料の作製とin vivoでのヌクレオソーム形成の評価法の確立により、本研究はおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に得られた結果から、ヒトゲノムに存在頻度が低く、レアなマイクロサテライト配列は、in vivoでのヌクレオソーム形成に対して抵抗性を有することが示された。この事実をさらに普遍的に検証するために、現在、4塩基対リピート配列についても系統的な解析を進めている。
In vivoとin vitroの両面から統合的に考察するために、マイクロサテライト配列のヌクレオソーム形成をin vitro再構成系によっても評価する。さらに、出芽酵母のPHO5のレポーターアッセイ系を用いて、ATTCTやCTGリピート配列など疾患に関連するマイクロサテライトの不安定化に関わる因子の探索を進める。
平成27年度は、大学院生2名と卒研生4名とともに、これらの研究計画を推進する。
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| Causes of Carryover |
平成27年3月中旬にRI実験施設の工事があり、予定していたRI実験を4月に延ばしたため（RI化合物の購入が予定よりも少なくなったため)。また、クローニング実験が順調にすすみ、2014年2月－3月に予定していたシーケンス解析依頼の件数が少なくなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に、RI化合物の購入とシーケンス解析依頼に使用する。
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