2016 Fiscal Year Research-status Report
出芽酵母におけるリボソームRNAの新規転写制御機構の解明
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26440009
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
笠原 浩司 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (40304159)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リボソームRNA遺伝子 / リボソームタンパク質遺伝子 / 転写 / 出芽酵母 / ペプチジルプロリルイソメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初申請で記載したΔhmo1Δfpr1二重破壊株の抑圧変異株について一昨年度、その生育回復の原因が15番染色体の重複に伴うリボソームタンパク質(RP:ribosomal protein)遺伝子の一つRPL25の倍加にあることを突き止め、二重破壊株の生育遅延が、RPL25の転写量の低下によるものと結論づけた。それを受けて昨年度は、Hmo1及びFpr1のRPL25における機能について研究を行った。RNA seq、及びノザンブロッティングによる遺伝子発現解析の結果、二重破壊株では野生株、及びそれぞれの単独破壊株に比べ、RPL25を筆頭に調べた全てのRP質遺伝子の転写が顕著に低下することが明らかとなり、両因子がRP遺伝子の転写に重要な役割を果たすことが示唆された。Hmo1がRP遺伝子プロモーターに結合して働くことは知られているため、Fpr1についてもRP遺伝子プロモーターへの結合をChIP法により調べた所、本因子が調べた全てのRP遺伝子プロモーターに結合することが明らかとなった。この結果は薬剤ラパマイシンと結合した状態での機能のみが古くから知られる一方、本来の生理的機能が不明であったFpr1（ほ乳類のFKBP12のオルソログ）の働きを明らかにした初めての例である。Fpr1の結合はHmo1に比べ2オーダー少なく、特徴的なDNA結合モチーフも持たないことから、本因子は直接DNAに結合するのではなく、何らかの転写因子を介してDNA上に局在すると予想された。RPL25プロモーターの限局を行った結果、Fpr1の結合にはRP遺伝子の主要転写因子Rap1の結合配列を必要とすることが明らかとなった。昨年度の研究から、Rap1がRP遺伝子プロモーター結合以降の転写活性化のどこかの段階においてFpr1を必要とすると予想される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Δhmo1Δfpr1二重破壊株の生育異常を抑圧する変異の原因遺伝子の同定に成功するとともに、Fpr1がRP遺伝子プロモーター上に局在し、転写を促進することを明らかにしたことは、それまで不明であった両因子が協調的に作用する標的が具体的になり、今後の解析の方向性と注力する対象が明確になったという点において本研究の一つのブレークスルーになったと考えられる。
Fpr1は高等真核生物のFKBP12のオルソログである。これらのタンパク質はFK506やラパマイシンなどの臨床上重要な薬剤の標的であること、及びその作用機構が明らかにされてから20年以上が経過しているにもかかわらず、薬剤の無い本来の状況における役割については、未だ不明である。本研究の成果は、Fpr1/FKBP12を始め、タンパク質の構造形成に重要な関与をすると考えられながらも、その役割がほとんど明らかになっていないPPIase (peptidylprolyl isomerase)活性を持つ因子の働きの一端を明らかにしたもので、これらの因子の機能解明の手がかりになるものと期待される。今年度は本研究における重要な発見があった一方、他の研究の論文投稿に多くの時間を割いたことから、それを差し引いて総合的に見ると「概ね順調に進展している」と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究結果を受けて、今年度は以下の3点を柱に研究を進めていく。
①Fpr1の標的遺伝子への局在化の仕組みの解明 - 昨年度、Fpr1の結合に必要なシスエレメントとしてRP遺伝子プロモーター中のRap1結合配列を同定したが、本年度はそれに必要なトランスエレメントの同定を目指す。具体的には、RP遺伝子プロモーターに結合すると考えられている（あるいはその可能性のある）転写因子の遺伝子破壊株（必須遺伝子の場合は既知の温度感受性変異株など）のバックグラウンドでFpr1のChIP解析を行い、Fpr1の結合に変化が見られる変異を同定する。
②Fpr1のプロモーター上での機能の解明 - Δfpr1とRP遺伝子プロモーターの転写に関わる因子の遺伝子破壊株もしくは変異株との掛け合わせを行い、Δfpr1と遺伝学的な相互作用のある因子の同定を目指す（既に同定されているhmo1変異以外を探す）。またこれと平行して、酵母細胞内でタンパク質間相互作用の検出が可能なCytoTrapシステムを用いてFpr1と相互作用する因子の探索を行う（通常のTwo-hybridスクリーニングではFpr1をbaitに用いることが出来ないことが分かっている）。
③Fpr1のRP遺伝子以外の標的の網羅的同定 - ChIP seq法を用いたゲノムワイドな探索により、Fpr1のRP遺伝子以外の標的を網羅的に同定する。それによってFpr1の働きの普遍性と多様性を明らかにするための手がかりを得る。
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| Causes of Carryover |
本年度に計画していた実験の一部が実施できなかったため、翌年以降に実施することとし、その実験に必要な額として確保しておいた費用を次年度へ繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰り越した額は前年度に実施できなかったFpr1のChIP seqアッセイに充てる予定である。
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Research Products
(1 results)
