2014 Fiscal Year Research-status Report
桿菌の形態形成に関わる細胞骨格蛋白RodZの構造とDNA/RNA結合能の解析
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26440014
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
三戸部 治郎 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (40333364)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), その他部局等, その他 (60314415)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バクテリア細胞骨格 / RNA結合蛋白 / DNA結合蛋白 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
赤痢菌の主要な病原因子であるIII型分泌装置の発現を指標に同定されたYfgA蛋白は、近年提唱されている新概念の“細菌の細胞骨格蛋白”(bacterial cytoskeleton)のひとつであるRodZとして細菌の形態形成に作用することが報告されている。申請者はRodZが形態以外の機能として核酸結合活性を持ち、そのRNA結合能が赤痢菌の病原遺伝子の転写後調節に作用することを示し、RodZが複数の機能を持つ重要な構造蛋白であることを明らかにした。本研究ではRNA結合能と複合体を構成する構造解析を進めると共に、DNA結合能を調べ、これまで報告されていないRodZの役割を明らかにする。
初年度は時間的な制約が多かったため、短期的に集中できる基礎的技術の改良を行った。具体的にはRodZ蛋白にダメージを与えずに精製する技術を改良するため、まず蛋白が可溶化できるように大量発現を誘導する至適条件を検討した。この条件ではRodZは内膜に局在するため、フィラメント状に伸長した菌体を形成することが観察された。精製法の改良では菌を界面活性剤を含まない低イオン濃度のバッファーに懸濁しフレンチプレスで破砕後、遠心し不溶性の膜分画だけを回収した。再度、膜分画に含まれるRodZを界面活性剤で溶解することで、大部分の細胞質由来の不純物を除き、最小限のカラム操作で高い濃度と純度に精製することができた。また、複合体形成のまとめとして、電子顕微鏡室の協力を得てペリプラズムに露出したRodZのC末端領域を電子顕微鏡で観察する系の作成にチャレンジした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度は短期的に集中できる内容に集中したため、バランスの取れた進行という視点では不満足な結果であった。本研究のテーマの一つであるRodZ蛋白複合体の形成機構では精製蛋白が6量体を形成しているところまで解析が進んだが、最終的に複合体が生体内で形成されているかを証明する必要がある。
ペリプラズム領域に露出しているはずの複合体を直接検出するため試作した免疫電顕法では、パラホルムアルデヒドで固定した菌でもリゾチームが作用することを検証し、桿菌状の形態を保ったまま細胞壁を破壊する至適なショ糖濃度を決定した。この細胞壁を溶解したプロトプラストを用いてRodZのC末端に付加したFLAGタグに対するモノクローナル抗体を作用させた。ところが電顕での本観察に先立って蛍光顕微鏡による評価を行ったところ、差は明らかなもののFLAGタグを付加していない野生型菌を用いた陰性コントロールでも無視できないレベルのバックグランドが出現した。
種々の方法でバックグランドを下げることを試みたが、現時点では良好な方法が得られておらず、電顕による観察の信頼性が担保できていない。こうしたことから、手法にはこだわらずフリーズフラクチャー法などの既存の方法での菌体内膜の観察を検討するか、生化学的な手法としてin vivoでのクロスリンク法でRodZ複合体を結合させ、SDS-PAGEやゲル濾過で複合体の分子量を測定することを検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はRodZの機能であるDNA・RNA結合能に集中する。RNAの結合能に関してはすでにマイクロアレイで野生型と欠損株でmRNA量の差異のある70近い遺伝子群を同定しており、それらの個々の遺伝子のmRNA対してリアルタイムPCRを行う。
DNAの結合能に関して、RodZ蛋白はランダムに放射能ラベルした大腸菌DNAと結合するが、特定の結合配列は知られていない。一方、RodZをターゲットにクロマチン免疫沈降法を行い、特定領域のDNA結合量をリアルタイムPCRで調べると、細胞分裂に伴った結合の増減が起こるため、RodZは弱い結合でDNAを繋ぎ止めていることが予想される。
RodZがおおむね均等に分布すると仮定すると、この増減は結合と解離を繰り返しているのか、それとも菌の分裂に従って結合する位置が変化しているのか判断が付かない。そのため、in situハイブリゼーション法を用いて特定領域を細胞周期ごとに染色し、菌内部でどのような位置変化があるかを調べる予定である。
また逆にRodZの一部を菌の特定の位置に固定させ、それだけでクロマチン免疫沈降法を行うことができれば、位置に関連してどのような変化が起こっているか判断できる可能性がある。極に局在する蛋白として赤痢菌のIcsA(VirG)があり、すでに局在に必須な領域が同定されている。そこでこれとRodZを融合させ、正常な状態で内膜にマウントされるかどうかを試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
年度末納品等にかかる支払いが平成２７年４月１日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
平成26年度分について実支出額が所要額に満たなかった理由として、研究環境の改善を見込んで、もともと初年度に多くの予算を計上したが、予想外に共用の試薬が利用でき予算がかからなかったことが最大の理由である。また他の業務のためで時間が取れなかったこと、実験法の改良に予想外の時間のかかったため、予定したペースで研究が進行せず、それに伴い予算執行が遅れたことが挙げられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の予定からは遅れるが、研究の進展に合わせて無駄を出さないよう予算を執行する。当初の計画に無い費用としては、平成２６年１１月より、部内の外国人ポスドクの指導を行い、当研究に関しても共同研究体制ができているため、パソコンを含むスタートアップ費用、ラボ設備、試薬費用を負担する予定である。
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[Journal Article] Epidemiological analysis of a large enterohaemorrhagic Escherichia coli O111 outbreak in Japan associated with haemolytic uraemic syndrome and acute encephalopathy.2015
Author(s)
Yahata Y, Misaki T, Ishida Y, Nagira M, Watahiki M, Isobe J, Terajima J, Iyoda S, Mitobe J, Ohnishi M, Sata T, Taniguchi K, Tada Y, Okabe N
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Journal Title
Epidemiol Infect PMID: 25600435
Volume: 20
Pages: 1-12
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O111 and O157 strains isolated from outbreak patients in Japan.2014
Author(s)
Watahiki M, Isobe J, Kimata K, Shima T, Kanatani J, Shimizu M, Nagata A, Kawakami K, Yamada M, Izumiya H, Iyoda S, Morita-Ishihara T, Mitobe J, Terajima J, Ohnishi M, Sata T.
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Journal Title
J Clin Microbiol.
Volume: 52(8)
Pages: 2757-63
DOI
Peer Reviewed
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