2015 Fiscal Year Research-status Report
桿菌の形態形成に関わる細胞骨格蛋白RodZの構造とDNA/RNA結合能の解析
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26440014
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
三戸部 治郎 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (40333364)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳原 格 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), その他部局等, その他 (60314415)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バクテリア細胞骨格 / 多量体形成 / RNA結合 / DNA結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
赤痢菌の病原性に必須なIII型分泌装置遺伝子の発現に作用する因子として同定されたYfgA(RodZ)蛋白は、全く異なる機能として、桿菌の桿状構造の形成に作用することから、“細菌の細胞骨格蛋白”(bacterial cytoskeleton)としても知られている。申請者はRodZが形態形成以外の機能として核酸結合活性を持ち、そのRNA結合能が赤痢菌の病原遺伝子の転写後調節に作用することを示した。本研究ではRNA結合能と複合体を構成する構造解析を進めると共に、DNA結合能を調べこれまで報告されていないRodZの役割を明らかにする。
RodZ蛋白の細胞質領域とペリプラスム領域には、一つずつシステイン残基が存在し、ジスルフィド結合で複合体を形成していることが予想される。今年度は構造と機能の相関を調べるため、このジスルフィド結合を形成すると予想される２ヶ所のシステイン残基をグリシンに置換し形態を観察した。
また、RNAの結合を網羅的に調べるため、野生型とrodZ欠損株のカルチャーに、mRNAの転写を停止させる薬剤であるリファンピシンを加え、mRNA量をマイクロアレイで比較することで、mRNAの分解速度が遅くなる約７０種類の遺伝子群をすでに同定してる。今年度はこれらが本当にRodZに直接結合しているか調べるためRodZを磁気ビーズで沈降した試料からmRNAを抽出し、それぞれの遺伝子群についてRNAの検出を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究はRodZのDNA結合、RNA結合、構造機能相関の３つ解析をテーマとしており、結果として順序には拘らず、構造とRNA結合能の解析から行った。達成度は65％程度と考えられる。
構造機能相関に関して、すでに平成23-25年度基盤研究Cで、高純度に精製したRodZ蛋白のジスルフィド結合部分にクロスリンク処理をかけ、未処理の単量体と質量分析で分子量を比較することで、RodZが正確にホモ６量体のストイキオメトリーを持つことを解明した。このジスルフィド結合が形態形成に与える影響を調べるため、発現プラスミドにクローニングしたrodZ遺伝子の２ヶ所のシステイン残基をグリシンに置換した。このプラスミドをrodZ欠損株の中で発現させることで構造と機能の相関を調べた。
RNA結合能に関して、すでにマイクロアレイによる解析で、RodZ に依存してmRNAの分解が遅くなる遺伝子群が同定されている。これらのRNAが生体内でRodZ蛋白に結合しているか調べるため、免疫沈降で結合したmRNA量をリアルタイムPCRで比較する系を作成した。予備的な実験では、非特異的な結合が無視できないため、紫外線でRodZとmRNAをクロスリンクし、8M ureaを含むバッファーで洗浄が可能なヒスチジンタグを染色体rodZ遺伝子に導入し、磁気ビーズで沈降したサンプルからmRNAを抽出しリアルタイムPCRを行う系を確立した。ピックアップされた計81遺伝子全てにリアルタイムPCRのプライマーを作成し増幅を調べた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAの結合能に関して、RodZは放射能ラベルした大腸菌のDNAと結合するが、特定の結合配列は同定されていない。そのことから真核生物のヒストンのように非特異的な結合でDNAを保持するメカニズムが予想される。特定の結合配列がないということと、ポテンシャルに結合能が低いということが、その証明を困難にしている。
今後はより単純な方法でRodZとDNA分子が共局在している形態を観察する方法を検討する。初年度に明らかにしたように、界面活性剤を含まない低イオン濃度のバッファーにはRodZ を含む内膜分画は溶解しないことを利用し、破砕した細胞膜上に残るRodZと共局在するDNAを免疫SEMで観察する。具体的にはRodZ蛋白とDNAをあらかじめにクロスリンクしておき、膜分画だけを洗浄し、細胞質側から両者が観察できないか検討する。
構造機能相関ではRodZが膜蛋白にも関わらず基本構造としてホモ６量体をとるのは、細菌の代表的なRNA結合蛋白であるHfqが６量体をとることに相似しており大変興味深い。今回明らかになったシステイン残基の機能に関して、より解析を進め、形態のみならずIII型分泌装置の発現やRNA結合に関する機能の変化を調べる。また初年度に上手く行かなかった形態観察によるRodZの多量体の証明に関しても、システイン欠損株と野生型とでRodZに対する蛍光抗体染色を行い、蛍光の密集度を比較することで、間接的な証明ができないか検討する。
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| Causes of Carryover |
予定していた受託解析が時間がなく、当該年度に実施できなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度に予定していた受託解析を実施する。
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[Journal Article] Epidemiological analysis of a large enterohaemorrhagic Escherichia coli O111 outbreak in Japan associated with haemolytic uraemic syndrome and acute encephalopathy.2015
Author(s)
Yahata Y, Misaki T, Ishida Y, Nagira M, Watahiki M, Isobe J, Terajima J, Iyoda S, Mitobe J, Ohnishi M, Sata T, Taniguchi K, Tada Y, Okabe N; E. coli O111 Outbreak Investigation Team.
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Journal Title
Epidemiol Infect.
Volume: 143
Pages: 2721-2732
DOI
Peer Reviewed
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