１９F-NMR法を用いた細胞内環境下におけるタンパク質の動的構造の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26440018
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小柴 生造 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 准教授 (70332301)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: In-Cell NMR / 19F-NMR / 動的構造

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，研究代表者が最近開発した19F標識技術とIn-Cell NMR 法を組み合わせて、生きた細胞内におけるタンパク質、特に代表者が解析してきたキナーゼの動的構造を解析する技術を確立し、これまで in vitro で解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を，本来タンパク質が機能しているin vivo の環境下で解明することを目的とする．本研究の平成２６年度における研究成果は以下の通りである．
１：In-Cell NMR法における感度の問題を克服するために高感度19F標識アミノ酸であるトリフルオロメチオニンによるタンパク質標識技術の最適化を行った。その結果、目標であるVRK1キナーゼタンパク質のトリフルオロメチオニン標識に成功した。さらに、19F標識VRK1タンパク質の大量合成・精製に成功し、超高感度19F-NMRスペクトルの測定にも成功した。
２：次に、得られたトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質を培養細胞に導入する実験を行った。その結果、少量ながら細胞内に標識タンパク質を導入することに成功し、生きた細胞内におけるトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質のNMRスペクトルの測定に成功した。現在導入量を増やすため条件検討を行っており、測定感度の向上を進めている。
以上の成果は、本研究の目的である、生きた細胞内における多様なタンパク質間相互作用の解析技術の開発や、細胞内におけるタンパク質の動的構造の解析に必要不可欠な技術であり、本研究の目標達成に大きく貢献した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、研究代表者が開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を組み合わせて、生きた細胞内におけるタンパク質、特にキナーゼの動的構造を解析する技術を確立し、これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を、本来タンパク質が機能しているin vivoの環境下で解明することを目的とする。平成２６年度は、予定通りIn-Cell NMR法に適したトリフルオロメチオニン標識キナーゼの大量合成に成功し、超高感度NMRスペクトルの測定に成功した。ただ、細胞内への標識タンパク質の導入効率の向上に手間取り、最終的な目標である細胞内での相互作用様式の解析までは至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後は当初の計画通り、トリフルオロメチオニン標識キナーゼの細胞導入率を上げてIn-Cell NMR法で測定することで、細胞内におけるタンパク質の多様な相互作用を高次構造レベルで解析する技術を確立する。さらに細胞内におけるタンパク質の動的構造変化を時系列で観測する技術を開発する。

Causes of Carryover

当初の計画では、平成２６年度に細胞内環境下における様々なタンパク質間相互作用の解析技術の確立を目標としていた。これまでにターゲットであるVKR1キナーゼタンパク質のトリフルオロメチオニン標識に成功し、大量合成・精製法を確立した。さらにこの標識タンパク質を用いて高感度19F-NMRスペクトルの測定に成功し、細胞への導入にも成功したが、細胞内への導入効率の最適化に時間がかかり、細胞内相互作用解析技術の確立が遅れている。このため、次年度に19F標識VRK1を用いた相互作用解析のための技術開発を行う必要が生じたため、次年度使用額が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は、細胞内に導入した19F標識VRK1を用いて細胞内相互作用解析技術を開発すると共に、細胞内における動的構造を解析するための技術を確立する。次年度使用額は、本研究計画の遂行に必要な細胞培養試薬類や各種安定同位体標識試薬などに、必要な経費を充てる計画である。