2017 Fiscal Year Annual Research Report
Protein 19F Labeling Strategy for In-Cell NMR and Functional Analyses
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26440018
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小柴 生造 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 教授 (70332301)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 19F-NMR / In-Cell NMR / 動的構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，申請者が最近開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を組み合わせて，生きた細胞内におけるタンパク質，特に申請者が解析してきたキナーゼの動的構造を解析する技術を確立し，これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を，本来タンパク質が機能しているin vivoの環境下で解明することを目的とする．本研究の平成２９年度の成果は以下の通りである。
平成２８年度に引き続き、細胞内で高感度に検出できる19F-NMR法に関して19F標識を含めた各種同位体標識法の開発を進めるとともにNMR測定の検討を行った。また酸化ストレス応答タンパク質Keap1に関しては、基質である転写因子Nrf2タンパク質との相互作用をNMRを用いて解析を行い、分子認識機構を高次構造レベルで明らかにした（投稿準備中）。さらに低分子結合に伴うNrf2の活性化がKeap1のどのような高次構造変化に由来するか19F標識等を用いて解析している。また細胞内におけるアロステリック効果等による制御機構を高次構造レベルで計測するため、アミノ酸代謝酵素であるPAHとASPGの大量発現系を構築し、現在解析を進めている。
本研究では研究期間全体を通じてタンパク質の各種19F標識技術を新たに開発し、細胞内環境下でのタンパク質の動的構造変化の解析に必要な高感度19F-NMR測定法の開発に初めて成功した。とくにトリフルオロメチル標識体の効果は絶大で、分子量が４万を超えるタンパク質でもNMRで高感度に測定可能である。また本標識はタンパク質の動的構造変化の解析のみならず、基質との相互作用を高感度に測定できることも証明した。これは細胞内環境下にような低濃度のタンパク質でも高感度に構造や相互作用情報を得ることができることを示しており、今後のタンパク質研究において非常に重要な手法として広く活用することが期待される。
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