2014 Fiscal Year Research-status Report
クランプローダーＲＦＣによるクランプＰＣＮＡ装てん機構の構造生物学的研究
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26440023
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
大山 拓次 山梨大学, 総合研究部, 助教 (60423133)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RFC複合体の結晶のクオリティ改善に向けて：MPDを主たる沈殿剤とした条件にてRFC複合体の結晶化を行った。結晶化ドロップ作成時のタンパク質とリザーバー溶液の混合比を、従来の1:1に加え、それ以外の条件で種々試した。その結果、タンパク質：リザーバー＝2:1で結晶化を行うと、より大きな結晶を得られる確率が高い上、ハーベスト溶液中での安定性も比較的高くなることが分かった。今後、ヌクレオチドソーキングや脱水処理により高品質化が達せられる可能性がある。
SeMetラベル化PCNAの大量発現と結晶化：RFC-PCNA-DNA3者複合体結晶構造の重原子同型置換法による構造解析を見据え、SeMet化PCNAの大量発現を行った。Met要求性では無く、通常の大腸菌を用いても、十分にラベル化された組換え体PCNAを大量に調製できることが分かった。さらに、精製したラベル化PCNAの結晶化を試みたところ、結晶構造解析に有用と期待される単結晶を得ることが出来た。今後、SeMet化PCNAのSAD法による結晶構造解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RFC複合体の高分解能構造解析に向けて：結晶化条件の詳細な検討により、従来よりも安定な結晶を得ることに成功した。したがって、この新たな結晶を用いることにより、高品質化に向けた研究は想定していたよりもスムーズに進行すると期待される。
SeMetラベル化PCNA：本年度はラベル化PCNAの発現および精製条件の検討が行えれば良いと考えていたが、予定よりも単結晶を得ることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
RFC複合体の高分解能結晶構造決定に向けて：新たに得られた安定なRFC複合体結晶を大量に調製し、高品質化に向けた結晶成長後のハーベスト条件（脱水法など）をより広範に検索する。
SeMet化PCNAの結晶構造解析：X線回折データ収集および構造解析計算を行い、PCNAに取り込まれたSeMetが構造解析に有用であること、および野生型PCNAと本質的に同じ立体構造を有していることを確認する。
RFC-PCNA-DNA3者複合体結晶化に向けて：複合体形成のカギになると考えられるテンプレート/プライマーDNAの長さについて十分に検討を行う。また、3者複合体を安定に保つために重要なATPアナログについては、これまで用いていたATPγSより有用となりうるアナログ化合物を探索する。RFCおよびPCNAの大量精製を行い、微量ゲルろ過システムにより、複合体形成条件を広範かつ緻密に検索する。
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| Causes of Carryover |
RFCおよびSeMet-PCNAの結晶化実験が想定していたよりも順調に進行したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
RFC-PCNA-DNA3者複合体再構成に必要な合成オリゴDNAについて、当初の予定よりも用いるDNAの種類を増やし、より広範な再構成条件検討を行う予定である。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Structural design and synthesis of arylalkynyl amide-type peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma)-selective antagonists based on the helix12-folding inhibition hypothesis2015
Author(s)
Ohashi M, Gamo K, Tanaka Y, Waki M, Beniyama Y, Matsuno K, Wada J, Tenta T, Eguchi J, Makishima M, Matsuura N, Oyama T, Miyachi H
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Journal Title
Eur J Med Chem
Volume: 90
Pages: 53-67
DOI
Peer Reviewed
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