2016 Fiscal Year Annual Research Report
Structural study on the clamp PCNA-loading mechanism by the clamp loader RFC
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26440023
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
大山 拓次 山梨大学, 総合研究部, 准教授 (60423133)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA複製 / タンパク質DNA複合体 / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度完成予定であったRFCの構造決定にはさらに一定の期間を要すると予想されたため、RFC単独の解析を一旦停止し、RFC-PCNA-DNAクランプ装てん複合体の解析に注力した。RFC、SeMetラベル化PCNA、ATPアナログ、および合成オリゴ2本鎖DNAを適切なモル比で混合し、複合体の試験管内再構成、精製および結晶化を試みた。RFCとSeMetラベル化PCNA は前年度に確立した改良プロトコールに基づいて調製した。ATPアナログにはATPγS、AMPPNP、AMPPCPを用いた。計画ではATPアナログとして二リン酸モノヌクレオチド+リン酸遷移状態アナログ化合物も用いる予定であったが実施できなかった。2本鎖DNAは種々の長さや配列を持つものを試した。精製は微量精製システムのゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。ゲルろ過におけるクロマトグラムとフラクションのSDS-PAGEによる成分分析から、ATPアナログにATPγS、DNAには20merの5’突出末端を持つ11mer 2本鎖DNAを用いた時にシャープなクロマトグラムを描くよう複合体が溶出し、総分子量は約30万、RFC、PCNA、DNAとも1分子ずつ含み、結晶化に適した機能複合体であることが示唆された。そのフラクションを用いて微量結晶化条件検索装置を用い、広範な条件で3者複合体の結晶化を試みたが、結晶の取得および構造決定には至らなかった。
研究期間全体を通じて振り返ると、RFCの高純度精製プロトコールの確立、SeMet化PCNAの2.5Å分解能で構造決定できたため、有意義な研究実施期間であった。また、DNA複製初期過程という観点で本研究と密接な関係があるMCMヘリカーゼ活性化因子の構造機能解析が、本研究に刺激を受けて成果発表にまで至ったことは特筆すべき成果である。
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Research Products
(8 results)
