2015 Fiscal Year Research-status Report
塩基除去修復における DNA 傷害の初期認識機構の解明
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26440030
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中川 紀子 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 招へい研究員 (50379278)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNA修復 / 塩基除去修復 / X線結晶構造解析 / 高度好熱菌 / Thermus thermophilus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA修復の過程で塩基除去修復酵素は、傷害塩基をフリップアウトさせて認識することが知られている。しかし、これは傷害塩基の認識過程の最終段階であり、初期段階でどのよう認識しているかは不明な点が多い。本研究では傷害認識の初期過程を明らかにする目的で、高度好熱菌 Thermus thermophilus HB8 由来の塩基除去修復酵素と DNA との複合体の立体構造解析を行っている。
これまでに MutM と 8-オキソグアニンを含む DNA との複合体、MutM と AP 部位を含む DNA との複合体、MutM と傷害を含まない DNA との複合体の3種類の複合体の結晶化に成功し、X線回折データの収集を行った。傷害を含む DNA との複合体に関しては立体構造解析の精密化の最終段階である。傷害を含まない DNA については精密化の途中である。これまでの解析の結果、傷害を含む DNA との複合体については他の塩基除去修復酵素と同様に傷害駅をフリップアウトさせて DNA 鎖を曲げて認識していることが分かった。一方、傷害を含まない DNA との複合体では塩基のフリップアウトや DNA 鎖の曲がりがないことが分かった。
さらにこのような違いが、他の塩基除去修復酵素にもあてはまるのかを調べるために、family 5 に属するウラシル DNA グリコシラーゼ UDG-B についても立体構造解析を進めている。これまでの研究から AP 部位を含む DNA との複合体では、DNA 鎖が曲がっていることが報告されている。そこで、傷害を含まない DNA との複合体について結晶化を試みたが、結晶化には至っていない。UDG-B と傷害を含まない DNA との結合力をゲルシフト法で測定すると、これまでに使用していた DNA の長さでは結合力が不十分であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では複数の塩基除去修復酵素について傷害のある DNA と傷害のない DNA との複合体の構造解析を行い、傷害認識の初期過程の一般法則を見いだすことを目的としている。
これまでに、塩基除去修復酵素 MutM について傷害のある DNA と傷害のない DNA との複合体の構造解析を行っている。本年度はさらにウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG-B) についても傷害のない DNA との複合体の構造解析を進める予定であったが、結晶化が困難で未だ回折データの収集には至っていない。よって、当初の計画より「遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
既に回折データの収集に成功している MutM の3種類の複合体の構造については精密化を完了させ、座標データを Protein Data Bank に登録し公開する準備を進める。
結晶化に難航している UDG-B については、DNA の配列や長さを変えて結晶化を試みる予定である。結晶化に最適な DNA の長さを確認するために、ゲルシフト法を使って複合体を形成するのに十分な結合能を有する DNA の長さを確認する。
UDG-B の結晶化が成功しない場合に備えて、既に基質を含まない立体構造の解析が終了している AP エンドヌクレアーゼ EndoIV や発現・精製方法が確立している他の塩基除去修復酵素 UDG-A や MutY について DNA との複合体の結晶化を行い、結晶化に成功したものについて立体構造解析を進める。
複数の DNA 修復酵素で傷害を含まない DNA との構造解析が成功した場合は、それらの構造を比較し傷害認識の初期過程に重要な役割を果たしていると考えられるアミノ酸残基を推定する。その残基の変異体の作製して DNA 結合能の有無、傷害塩基のフリップアウトの有無、グリコシラーゼ活性の有無を測定し、立体構造解析から推定した傷害認識の初期過程のモデルについて検証する。
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| Causes of Carryover |
平成 27 年度中に行う予定であった2つ目の塩基除去修復酵素 UDG-B と傷害を含まない DNA との複合体の結晶化が難航している。結晶化に成功した際は大型放射光施設に滞在し、高分解能の回折データの収集を行う予定であったが、その実験が行われなかったために旅費などに必要な予算が使用されなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
引き続き UDG-B と傷害を含まない DNA との複合体の結晶化を続けると同時に、他の塩基除去修復酵素と DNA との複合体の結晶化も試みる。これらの実験には、様々な配列・長さの DNA が必要であり、高純度の合成オリゴ DNA を発注するために物品費を使用する。さらに結晶化が成功した際は、大型放射光施設を利用して高分解能の回折データを測定するために、旅費を使用する。
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Research Products
(1 results)
