2015 Fiscal Year Research-status Report
微小管構成タンパク質αチューブリンのアセチル化酵素による基質認識の構造基盤
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26440033
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
湯澤 聡 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (40515029)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 微小管 / 翻訳後修飾 / X線結晶構造解析 / 酵素 / 分子認識 / 酵素反応 / 蛋白質 / 基質特異性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管の翻訳後修飾の一つであるアセチル化修飾は，安定な微小管に特徴的に見られることが知られており，一次繊毛の軸糸, 神経細胞の突起, 遊走細胞で顕著に観察される．微小管の主要なアセチル化酵素であるα-tubulinアセチル化酵素αTAT1は，α-tubulin のLys40に対し高い特異性を示し，アセチル基の供与体であるアセチルCoA (AcCoA)からα-tubulinの40番目のリジン残基へとアセチル基を転移する．本課題では，αTAT1の基質認識機構や制御機構について明らかにすることを目的としている．
本年度は，さらに詳細な認識機構を明らかにするためαTAT1とα-tubulin由来のペプチドとの複合体の結晶構造解析を実施した．α-tubulinの40番目のリジン残基近傍のアミノ酸を含む領域を基質として，6-14残基のα-tubulin由来のペプチドをペプチド合成により調製した．このペプチドを基質として用い，αTAT1とアセチルCoAやCoAとの三者複合体について結晶化を試み，得られた結晶について回折実験を行った．異なる結晶型に属する複数のαTAT1複合体が得られ，その結晶構造をそれぞれ1.5-2.8オングストローム分解能で決定した．しかし，α-tubulinペプチド由来の電子密度は観察されず，結晶中では複合体を形成していなかった．そこで，変異体実験に基づき基質認識に関与する残基を含む14残基のα-tubulin由来のペプチドを基質として用意し，再度三者複合体の結晶化を試みた．得られた結晶は，これまで得られていた結晶とは異なり，αTAT1の活性中心近傍に未帰属の電子密度が観察された．この電子密度はα-tubulinペプチド由来の電子密度と想定されるが，専有率が低く三者複合体の構造決定には至っていない．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該課題で設定した研究項目のうち，当年度はCoA/AcCoA-αTAT1とα-tubulin由来のペプチド基質との三者複合体の結晶構造解析を進めた．基質ペプチドの長さを変え結晶化条件の検討を実施し，得られた複合体にはαTAT1複合体の活性中心近傍にα-tubulinペプチドと想定される未帰属の電子密度が観察された．今後，条件検討を進めαTAT1三者複合体の構造決定を目指す．
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画に従い，当該課題を推進する予定である．αTAT1の基質特異性を明らかにするため，AcCoA/CoA-αTAT1複合体にα-tubulin由来基質ペプチドが結合した三者複合体についてX線結晶構造解析を行う．三者複合体の構造解析で得られた知見に基づいて変異体を作成し，酵素活性や細胞内での機能を検討することを計画している．
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