2014 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
26440035
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
多田 俊治 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70275288)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | Ｘ線結晶構造解析 / MAPキナーゼ / MEK1 / 活性制御機構 / DFG motif |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は，MAP2KであるMEK1を対象とし，その２箇所の不規則領域，D208～Y240 (活性化ループと呼ばれ分子スイッチ機能を持つ)およびG276～P307 (活性抑制や自己リン酸化に関与する)，の示すコンフォメーション変化と酵素機能との相関を明らかにすることを目的とする。
今年度は，Ｎ末端から38残基を切断したヒト型MEK1の疑似活性体(MEK1Δ38(S218D/S222D))および疑似活性阻害体(MEK1Δ38(S212D/S218D/S222D))のＸ線結晶構造解析を実施した。活性体は大型放射光施設SPring-8にて回折Ｘ線測定を行い，HAG法を適用することにより2.7A分解能のデータの収集を達成した。構造解析の結果，コンフォメーションの異なる２種のMEK1が存在し，一方には，AMP-PNPとMg2+イオンが結合しDFG-motifはin構造を，もう一方には，AMP-PNPのみが結合しておりDFG-out構造をとっていることが見出された。これにより，Mg2+イオンがDFG-motifのin, outに重要な役割を担っていることを強く示唆された。さらに，DFG-in構造の方では活性化ループが大きく揺らいでいることが明らかとなり，揺らぎが基質結合を有利に導き，基質が結合することによりαCへリックスのin構造が安定化する、といった活性化機構が示唆された。活性阻害体では，3.5Aのデータを収集し，Mg2+の存在無しにADPがATP結合部位に入り込んでいること，D212の位置は既知構造でのS212の位置と大きく異なっていること，DFG-motifはin構造を取っていることが見出され，S212のリン酸化はMg2+を介さないATPの結合を優位とし、結果として下流キナーゼのリン酸化反応を抑制するという機構が考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
構造解析は研究計画通りに進展している。特に，疑似活性体については一定の成果を挙げる事ができたことから論文投稿を進める予定である。また，ATP類似化合物との親和性の表面プラズモン測定による評価も実施しており，計画全体としても概ね順調に進展している。ただ，疑似活性阻害体のデータの質が不十分であり，より良質な結晶の調製を行い再測定を実施したいとは考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
H27年度もMEK1活性化ループのコンフォメーション変化の構造要因の解明を目指し，計画通りに進める予定である。特に，疑似活性阻害体(MEK1Δ38(S212D/S218D/S222D))のより高精度な構造解明，疑似活性体と基質ペプチドとの複合体の構造解明，これらMEK1や部位特異的変異体のATP類縁体や阻害剤との会合能を評価する。基質ペプチドとの複合体の適切な結晶が得られるかどうかは不明であり，結晶性困難であることも視野に入れて，類似した構造に基づく計算化学的手法を用いた構造予測を行う予定にしている（長浜バイオ大学・白井教授との共同研究）。また，他の変異体の大腸菌を用いた発現系の構築を行う。
|
| Causes of Carryover |
疑似活性阻害体(MEK1Δ38(S212D/S218D/S222D))の結晶性が良好ではなかった理由につき種々に検討した結果，精製度合いに問題があるとの結論に至った。そこで，H26年度に購入予定にしていたAKTAの陰イオン交換カラムの購入を控え，H27年度に新たな精製システムを構築するために予算を使うこととした。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
シリカを基剤とした樹脂を用いた新たなイオン交換カラムを自作する。そのために，シリカ樹脂およびカラム管などを購入する。また，H27年度は新たな変異体の調製方法の検討が必要であり，特に粗精製用のHisTrapカラムを多用することが考えられることから，そのためにも予算を使いたいと考えている。
|
