2015 Fiscal Year Research-status Report
動的・機能的構造情報に基づく銅/トパキノン含有アミン酸化酵素の反応解析
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26440037
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 中性子 / 酵素 / 補酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
銅含有アミン酸化酵素は，生物界に広く分布し種々の生理活性アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する．本研究は土壌細菌Arthrobacterglobiformis由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，高分解能X線結晶構造解析，および中性子結晶構造解析を中心とした解析により，タンパク質のダイナミクスによる酵素触媒反応の進行の詳細を明らかにすることを目的とする．本年度は広pH領域における反応中間体の高分解能X線結晶構造解析，および中性子結晶構造解析に向けた大型結晶の調製と得られた結晶に対する回折測定を行った．
Ｘ線結晶構造解析については，嫌気定温HAG法（HAG法：Humid Air and Glue-coating method）を用いた広pH領域での構造解析を行い，プロトン化状態，すなわち静電的相互作用によって引き起こされるコンフォメーション変化の制御機構を解明することを試みた．現在，測定がほぼ終了し構造精密化を行っているが，pHを変化させることにより平衡が移動し，様々な状態の反応中間体構造が得られた．基本的にこれまでの我々が提案した反応スキームに沿ったものであるが，いくつかの新規の中間体構造も検出できた．
中性子構造解析については，結晶化条件の工夫により測定用の大型結晶の作成（最大8-10 mm3程度）に成功した．また平成27年度のJ-PARCでの測定課題に採択され，回折測定を行ったところ分解能1.7 Å程度の回折像が得られ，現在構造精密化をおこなっている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は研究2年目であり，昨年度決定した測定条件に基づき本測定を行った．
近年，酵素反応中間体のX線結晶構造解析が多数報告されているが，これらは酵素結晶中に基質をソーキング後，液体窒素あるいはフラッシュクーリングなどにより反応を停止させ，その後回折測定を行う方法がほとんどである．しかし，この場合得られた結晶が一体何度の構造を反映しているのか？という疑問が残る．ほとんどの化学反応（特に平衡状態）は温度の影響を大きく受けるため，例えば結晶凍結操作手順のわずかな違いが大きな実験データのバラツキとなる．本研究では，HAG法を利用することにより定温の中間体結晶を得ることが可能となった．
中性子構造解析については，昨年度決定した条件に基づき大型結晶を得ることに成功し，J-PARCのBL03ビームラインにて本測定を行った．現在精密化の途中であるが，水素（正確には重水素）の原子核密度を明確に検出することに成功している．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度までに最低の目標となるデータの取得に成功しており，平成28年度ではデータ解析を行いつつ少しチャレンジングな測定を行う．
X線結晶構造解析においては，引き続きHAG法による反応中間体の構造解析を行うが，さらに湿度調整ガスの温度を変化させることにより，結晶内で平衡を移動させ温度変化によるOn-Cu/Off-Cuのコンフォメーション変化を直接観察することを試みる．
中性子結晶構造解析においては補酵素形成反応中間体の結晶回折実験を行うことを予定している．
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| Causes of Carryover |
平成27年度は研究が比較的順調に進みほぼ予算を使い切ったが，年度末に予定した出張が取りやめとなり数万円残った．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
未使用額は測定施設（SPring-8, J-PARCなど）までの旅費に使用する．
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