2016 Fiscal Year Research-status Report
動的・機能的構造情報に基づく銅/トパキノン含有アミン酸化酵素の反応解析
| Project/Area Number |
26440037
|
|---|
| Research Institution | Osaka Medical College |
|---|
Principal Investigator |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 中性子結晶構造回析 / X線結晶構造回析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
銅含有アミン酸化酵素は，生物界に広く分布し種々の生理活性アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する．本研究は土壌細菌Arthrobacter globiformis由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，超高分解能X線結晶構造解析，および中性子結晶構造解析を中心とした研究により，タンパク質のダイナミクスによる酵素触媒反応の進行の詳細を明らかにすることを目的にする．本年度は昨年度に中性子回折実験を行った酸化型酵素（基質フリー型）の結晶に対してX線回折測定を行い，また，反応中間体結晶に対し，予備的な中性子結晶構造解析を行った．
X線回折測定で良好な反射が得られ，中性子/X線の同時精密化を行った結果，酸化型酵素については分解能：1.72 Å;（中性子）/ 1.14 Å;（X線）の結晶構造を決定した．これまでタンパク質の中性子結晶構造解析は30種類程度行われているが，分子量が1,000-2,000程度の比較的小型のものが大半であり，AGAO（サブユニット分子量72000のホモダイマー）はこれを大幅に上回る．現在構造の精密化を行っているが，予想外の位置に水素（重水素）の核密度が検出され，これまでに提案された反応機構を大幅に書き換えることが見込まれる．
また反応中間体については，予備測定の段階であるが2.5 Å程度の分解能が得られた．分解能をさらに上昇させるべく，現在試料調製方法の検討を行っている．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初予定していた最終年度であり，酸化型（基質フリー型），反応中間体両方の中性子結晶構造解析が終了する予定であった．しかし昨年度2度にわたりJ-PARCが長期停止してしまい，その影響で，約１年程度研究が遅れたため，本課題は研究期間を１年延長する．それ以外の点では研究はおおむね順調に進行しており，１年延長により当初計画していた研究は基本的に完成できる見込みである．特に酸化型酵素については極めて良好なデータの取得に成功し，論文化に向けて最終の解析を進めている．
|
| Strategy for Future Research Activity |
基質フリー型である酸化型酵素については良好なデータが得られたが，セミキノン中間体については，基質ソーキング中，もしくは凍結時に結晶が破損し，良好な反射が得られなかった．以前，比較的小型な結晶を用いて同条件のX線結晶構造解析を行った際にはこのようなことは見られなかったので，これは結晶が桁違いに大きくなったためと考えられる．
現在はよりマイルドな条件で基質ソーキングをするための条件検討を行いつつ，凍結時にも結晶が割れるため，嫌気ボックス中に簡易の窒素ガス吹き付け装置を作成し，吹き付けガスによる凍結を行う予定である．
|
| Causes of Carryover |
本研究はJ-PARCでの測定が必須であるが，昨年度2度にわたりJ-PARCが長期停止してしまい，その影響で約１年程度研究が遅れたため，１年分弱の予算を残し，研究機関を１年延長することとした．
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度は主に結晶調製用の試薬および測定施設（SPring-8, J-PARC）までの旅費に使用する．
|
