2014 Fiscal Year Research-status Report

イネ顆粒結合型デンプン合成酵素によるデンプン合成反応機構の解明

Research Project

Project/Area Number	26440038
Research Institution	National Institute of Agrobiological Sciences
Principal Investigator	藤本瑞独立行政法人農業生物資源研究所, 生体分子研究ユニット, 研究員 (20370679)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	顆粒結合型デンプン合成酵素 / イネ / Ｘ線結晶構造解析 / 糖鎖結合複合体
Outline of Annual Research Achievements	顆粒結合型デンプン合成酵素I (GBSSI: granule-bound starch synthase I) は、植物デンプンのアミロース生合成に関与する生化学上重要な酵素であるとともに、穀物品種ではモチ性に関与する重要な育種標的であり、GBSSIの基質認識機構をX線結晶構造解析により明らかにするため、イネのGBSSIの大腸菌による大量発現系を用いてGBSSIの調製を行い、生産物であるアミロースの部分構造を持つグルコース重合度４、５のマルトテトラオース、マルトペンタオースとの複合体の結晶化を行った。以前結晶構造に至った、立方晶系の空間群P432に属する立方体に近い形の結晶は、比較的再現良く作製することができた。3.0Å分解能のX線回折データを高エネルギー加速器研究機構放射光施設で取得し、電子密度を計算したところ、ドメイン閉鎖型立体構造が得られたが、マルトオリゴ糖の結合は見られなかった。さらに、結晶化条件の検討を進めたところ、マルトテトラオースとの共結晶化で作製した結晶が、従来の立方体ではなく、球状多面体結晶として現れたため、この結晶のX線回折データを取得したところ、空間群が立方晶系から正方晶系に変わったことが明らかとなった。結晶の対象が１軸方向で消失したことから、糖複合体化により、分子パッキングが変化したものと考えられた。ただし、結晶格子の軸の長さが、２軸方向に対し、153から217Åと1.5倍ほど伸びており、それに合わせてX線回折データの分解能が低くなったため未だ構造決定には至っていない。結晶格子の異なる新たな結晶を得ることができたため、今後結晶化条件の精密化をすすめ高分解能データの取得することで構造決定ができるものと考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason GBSSIと糖鎖との複合体の結晶作製および構造解析については、マルトテトラオースとの共結晶化で作製した結晶が、従来の結晶とは異なる形状、空間群であったことから、複合体の結晶ができたものと考えられる。分解能が未だ十分ではないが、今後結晶化条件を検討しながら、結晶作製を続けることで、糖複合体の立体構造が得られると考えられるので、一定の進歩であると考える。一方、構造活性相関のため、GBSSIの重要と思われる部位に変異を施そうとしたが、変異体タンパク質についてはいずれも不安定化して、精製タンパク質として取得が困難であった。もとより、不安定性が若干見られた試料であったため、変異体タンパク質の調製には、今後詳細な検討を要すると判断した。
Strategy for Future Research Activity	酵素変異体作製と機能解析については、GBSSIとマルトテトラオースとの複合体の結晶化条件を詳細に検討し、結晶作製を続け結晶の質とデータの分解能を向上させて、糖複合体の立体構造を決定することでGBSSIのマルトオリゴ糖認識機構を明らかにしていく。また、酵素反応では、アミロース伸長反応のアクセプターであるマルトオリゴ糖の他に、グルコースドナーであるADPグルコースもかかわる。そのため、GBSSIとADPグルコースとの複合体の結晶化、およびGBSSIとマルトテトラオーズ、ADPグルコースの３者複合体の結晶化条件の検討を進める。生化学研究では、大腸菌でGBSSIの発現を行った際、あるいは精製状態で不安定であることが問題となっている。そのため、安定な生化学実験を進める条件を検討する必要がある。安定化させるバッファーや可溶化剤、添加剤の検討、N末端、C末端の余分なアミノ酸残基の削り込みなど、GBSSIを安定化するための実験条件検討を進めて行く。また、最近麦由来のデンプン合成酵素の立体構造の報告があった。これは、顆粒結合型ではないため、直鎖アミロース伸長に限らない合成反応を司るものと考えられるが、それぞれの合成酵素が、どこでその特徴を発現しているかを明らかにする上で非常によい比較対象であるため、それぞれの立体構造を比較、精査し、構造機能相関を明らかにするためのあらたな構造解析、機能解析法を検討する。
Causes of Carryover	構造解析と生化学の２系統の実験のうち、生化学実験で試料が不安定化するという想定外の問題が生じたため、こちらの実験が予定通り進められなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	生化学実験を進めることができるよう、タンパク質試料の発現精製条件検討を詳細に行うことにしたので、その実験を行うために使用する。