Structural basis of substrate recognition and regulation by ADAM/ADAMTS family proteinases

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26440040
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 武田 壮一 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (80332279)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: プロテアーゼ / マルチドメイン / 複合体 / モジュラータンパク / 基質認識 / 活性制御 / 前駆体 / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

本研究は細胞膜上の主要なシェディング酵素であるADAMファミリープロテアーゼとその類縁の可溶性プロテアーゼであるADAMTSファミリーを対象に、それらプロテアーゼの基質認識と活性制御のメカニズムを明らかにすることを目的とする。本研究では、課題の一つとして、前駆体ADAMが持つ構造未知のプロドメインに着目し、その立体構造を明らかにすることで、酵素の不活化機構を明らかにすることを進めている。これまでプロドメインを含むヒト膜型ADAMプロテアーゼ前駆体の細胞外ドメインの大量発現系の構築を進めてきたが、残念ながら結晶化に供する量の発現タンパク質を得ることに成功していない。昨年度後半に、ヒト膜型ADAMの細胞外ドメインと相同性の高い、ガラガラヘビ毒由来のVAP2の全長前駆体分子についてSf9細胞を用いて分泌発現することに成功した。その後大量調製法を確立し、結晶化を進めたが、再現性良く単結晶を得ることが困難であることが判明した。そこで、以前の研究で可動性の高いドメインとして同定した分子C末端領域のChドメイン部分を欠損した分子揺らぎの少ない変異体タンパク質VAP2ΔChを設計し、大量発現、精製を行い、結晶化スクリーニングを行った。VAP2ΔChは多様な条件下で結晶化することが分かり、結晶の再現性も確かめられた。結晶化条件の最適化を進めたところ、得られた結晶の外見から分子パッキングの異なる複数の型の結晶が生じていることが分かった。研究最終年度内でのX線回折データの収集は間に合わなかったが、2018A期にSPring-8ビームラインでの回折データの測定を予定している。プロドメイン以外は既知構造であり、分子置換法による構造解析により、初めてプロドメインの立体構造が明らかになり、不活性な前駆体ADAMから成熟型ADAMへの転換のメカニズムが明らかになることが期待される。