光駆動型ナトリウムポンプの生理的意義とイオン輸送機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26440042
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊川 峰志 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 講師 (20281842)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮内 正二 東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 微生物ロドプシン / ナトリウムポンプ / レチナール / フォトサイクル

Outline of Annual Research Achievements

ロドプシンは、光センサーや光駆動型イオンポンプとして機能する膜タンパク質である。イオンポンプ型ロドプシンは、「光で瞬間的に活性化できる」という性質によって、輸送に含まれる要素反応を詳細に検討できる優れたモデルタンパク質である。本研究では、2013年に真正細菌から見出された新規のイオンポンプ型ロドプシンであるNa+ポンプ型ロドプシン（NaR）の要素反応を明らかとし、そこに係る重要アミノ酸残基の同定を通して、NaRの分子機構を考察する。本年度は以下の成果を得た。
１．海洋性真正細菌を中心に10種ほどのNaRが報告されている。その中から、ポルトガルの温泉流水に生息する真正細菌がもつ２種のNaR（TR1、TR2）について、大腸菌発現系を構築した。低温下で、長時間の発現誘導を行うことによって、1 L培地あたり5 mgの収量が得るに至った。
２．多くのNaRは、相互に高い相同性を有しているが、TR1, TR2は、他のNaRとは際立って相同性が低い。そのため、これらの機能解析を通して、Na+輸送にとって真に重要な機構の知見が得られると期待される。これまでに報告されたNaRでは、光照射後に、短波長側に吸収をもった光反応中間体（M中間体）が生成する。しかし、TR1とTR2では、この中間体が出現しないことが明らかとなった。M中間体は、ロドプシンが内部に保持している色素からH+イオンが解離することで生成する中間体である。このH+移動は、正電荷をもつNa+イオンのタンパク質内移動と密接に係ると考えられている。しかし、TR1とTR2の結果は、真に重要な反応は、H+移動そのものではなく、H+移動のきっかけとなり得る構造変化であることを示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、NaRを膜輸送担体のモデル蛋白質として捉え、その輸送分子機構の解明を目指している。目的達成のための具体的な研究項目として、以下の３点を設定している。
１．各輸送中間体で起こる要素反応を明らかとする。
２．輸送に重要なアミノ酸残基を同定する。
３． NaRの生理的意義を解明する。
１と２を行うために、TR1, TR2の大腸菌発現系を構築した。また、１に関しては、発現精製したTR1, TR2を用いて、過渡吸収分光法を用いた光化学反応の解析を行い、他のNaRでは見られない特徴を見出すことができた。一方、３の知見を得るために、TR1,TR2をもつT. radiovictrixを複数の条件で培養し、この生菌を用いて、Na+輸送活性測定を行ったが、明確な活性は検出できなかった。

Strategy for Future Research Activity

「現在までの達成度」欄に記載したとおり、本研究では、３点の具体的な研究項目を設定している。１と２は密接に関連している。入念な解析によって１を進展させ、その結果を踏まえて、２を効率的に進める。１を進展させるため、以下の二つの内容に取り組む。
(1) TR1, TR2の光化学反応に現れるNa+濃度依存性を明らかとし、Na+の放出と取り込みが起こる光反応中間体を推定する。
(2) Na+の放出・取込みを直接的に観測するため、Na+感応膜を用いた時間分解測定系を構築する。
３を進展させるためには、「NaRは保持するが、他の光駆動型イオンポンプや光合成装置をもたない細菌」を用いる必要があるが、現在のところ、この条件を満たすのは、T.radiovictrixのみである。したがって、引き続き、培地の栄養成分や培養温度などを変更しながら同菌を培養し、NaRの発現が誘導される条件を探索する。

Causes of Carryover

本研究では、ロドプシンを可溶化するために、dodecyl-β-D-maltoside（DDM）という界面活性剤を用いている。非常に高価であるため、その予算を多く計上していたが、TR1, TR2の大腸菌における発現量向上を実現できたため、DDMの使用量を、当初想定していたよりも減らすことができた。そのため、少額ではあるが、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

「今後の研究の推進方策」で記述した通り、Na+感応膜を用いた測定系の構築を計画している。このために用いる、タンパク質の化学修飾試薬、電極の表面改質用試薬、さらに、上述したDDM、遺伝子工学用試薬、光学部品、電気生理器具などの消耗品の購入、および、学会出席のための旅費に使用する。

Research Products

• [Journal Article] The effects of chloride ion binding on the photochemical properties of sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis (2014)
  • Author(s): Tamogami, J., Iwano, K., Matsuyama, A., Kikukawa, T., Demura, M., Nara, T., Kamo, N.
  • Journal Title: J. Photochem. Photobiol. Sci. Volume: 141 Pages: 192-201
  • DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2014.10.010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction between tachyplesin I, an antimicrobial peptide derived from horseshoe crab, and lipopolysaccharide (2014)
  • Author(s): 2)Kushibiki, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Kumaki, Y., Kikukawa, T., Mizuguchi, M., Demura, M., Kawabata, S., Kawano, K.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta Volume: 1844 Pages: 527-534
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2013.12.017
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Photochemistry of the H+-pumping rhodopsin from freshwater Actinobacteria (2014)
  • Author(s): Nakamura, S., Kikukawa, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Hahn, M.W., Kamo, N., Demura, M.
  • Organizer: 16th International Conference on Retinal Proteins
  • Place of Presentation: 長浜ロイヤルホテル（滋賀県）
  • Year and Date: 2014-10-05 – 2014-10-10
• [Presentation] The importance of Thr218 for Cl--pumping photocycle of Natronomonas pharaonis halorhodopsin (2014)
  • Author(s): Shibasaki, K., Shigemura, H., Kikukawa, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Kamo, N., Demura, M.
  • Organizer: 16th International Conference on Retinal Proteins
  • Place of Presentation: 長浜ロイヤルホテル（滋賀県）
  • Year and Date: 2014-10-05 – 2014-10-10
• [Presentation] Proton Transfer Reactions of Anabaena Sensory Rhodopsin (2014)
  • Author(s): Hasemi, T., Kikukawa, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Jung, K.H., Kamo, N., Demura, M.
  • Organizer: 16th International Conference on Retinal Proteins
  • Place of Presentation: 長浜ロイヤルホテル（滋賀県）
  • Year and Date: 2014-10-05 – 2014-10-10
• [Presentation] Acetabularia rhodopsin II (ARII)のAsp81変異体による一過性光誘起電流 (2014)
  • Author(s): 宮内正二, 下野和実, 菊川峰志, 出村誠, Jung, K.H., 加茂直樹
  • Organizer: 第５２回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-26 – 2014-09-26
• [Presentation] 固体NMR法によるタンパク質立体構造解析への常磁性緩和促進の応用 (2014)
  • Author(s): 田巻初, 江川文子, 木戸浩貴, 亀田倫史, 神谷昌克, 菊川峰志, 相沢智康, 藤原敏道, 出村誠
  • Organizer: 第５２回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-26 – 2014-09-26
• [Presentation] Truepera radiovictrix由来Na+ポンプ型ロドプシンの機能解析 (2014)
  • Author(s): 後藤歌月, 菊川峰志, 長谷見崇俊, 斉藤優太, 神谷昌克, 相沢智康, 加茂直樹, 出村誠
  • Organizer: 第５２回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-25
• [Presentation] アクチノロドプシンのHis-62残基の光化学反応における役割 (2014)
  • Author(s): 中村槙太郎, 菊川峰志, 神谷昌克, 相沢智康, Hahn Martin W, 加茂直樹, 出村誠
  • Organizer: 第５２回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-25