2014 Fiscal Year Research-status Report
蛋白質工学的手法による酸化ストレス下で働く新規グロビン蛋白質の機能制御機構の解明
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26440047
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
若杉 桂輔 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (20322167)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / ストレス / シグナル伝達 / 生理活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトのアンドログロビン(Adgb)は2012年に発見された精巣特異的に発現しているグロビン蛋白質であり、グロビンドメインとカルパイン類似ドメインとからなる融合蛋白質である。驚いたことに、グロビンドメインがcircular permutated型であり、しかもその間にカルモジュリン結合モチーフが挿入されている。Adgbの研究はこれまで遺伝子レベルでの研究が少しなされているだけで、蛋白質レベルでの研究はこれまで全く行われていない。そこで、本研究では、Adgb蛋白質の構造と機能を解析することを目指す。Adgb は巨大な蛋白質であることから、ドメインごとに分割したAdgb切断片を大腸菌を用いて発現させ、精製方法を確立した。さらに、精製したAdgb断片を抗原にしてポリクローナル抗体を作製した。今後、このAdgbに対するポリクローナル抗体を用いて、Adgbの蛋白質発現解析を推し進めていく予定である。また、各種Adgb 切断片をHeLa 細胞で発現させることも試みた。さらに、本研究では、ヒトのニューログロビン(Ngb)が持つ酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きの作用機序を明らかにすることも目指す。NgbをbaitとするYeast two hybrid screeningによりNgbと結合する相手であることを我々が明らかにしたcystatin C及びflotillin-1の機能を解析するとともに、これら蛋白質とNgbとの蛋白質間相互作用に着目した解析を行い、結合部位のアミノ酸残基の候補を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、ヒトAdgb 蛋白質の大腸菌での発現系の構築、及び、蛋白質の精製手法の確立を目指した。Adgb は巨大な蛋白質であることから、ドメインごとに分割した各種のAdgb切断片を大腸菌発現系と培養細胞発現系において発現させて解析を進めた。大腸菌発現系では、様々な条件で発現を試み、Adgb切断片の発現の条件を決定し、その精製に成功した。さらに、精製したAdgb断片を抗原にしてポリクローナル抗体を作製した。今後、このAdgbに対するポリクローナル抗体を用いて、Adgbの蛋白質発現解析を推し進めていく予定である。培養細胞発現系では、各種Adgb 切断片をHeLa 細胞で発現させた。さらに、本研究では、ヒトのニューログロビン(Ngb)が持つ酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きの作用機序を明らかにするために、Ngbが結合する相手であるcystatin C及びflotillin-1の機能解析、及び、これら蛋白質とNgbとの蛋白質間相互作用に着目した解析も行い、相互作用部位の候補を絞ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. ヒトAdgbと結合する蛋白質の探索
ヒトAdgbをbaitとして提示しヒト精巣cDNAライブラリーをpreyとして用いるyeast two hybrid screeningよって、ヒトAdgbと結合する分子の特定を目指す。結合する分子を特定した後、大腸菌による蛋白質の大量発現系・蛋白質精製手法を確立し、構造・機能解析を推し進める。
2. ヒトNgbの神経突起伸長の分子制御機構の解明
最近、ヒトNgbに神経突起を伸長させる働きがあることが明らかになった。そこで、我々が見い出した「ヒトNgbが三量体G蛋白質のαサブユニットGαi/oに結合し、GDP解離阻害因子(GDI)として働く」というNgbの特性に着目し、ヒトNgbを持つGDI活性の神経突起伸長における重要性について検証する。具体的には、GDI活性を失くしたNgb変異体を用いて、神経突起を伸長させる働きがあるかどうか解析する。
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| Causes of Carryover |
試薬の注文が遅くなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品（試薬）の購入に使用する。
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