2014 Fiscal Year Research-status Report
ユビキチン様タンパク質Atg8の新規結合様式とその生物学的意義
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26440052
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡本 徳子 大阪大学, 生命機能研究科, 特別研究員 (RPD) (90568750)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 出芽酵母 / 品質管理 / 膜ダイナミクス / オートファジー / ユビキチン様タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Atg8はオートファジーに必須であり、リン脂質PEに共有結合し、隔離膜やオートファゴソームに局在して機能する、ユニークなユビキチン様タンパク質として知られている。そして、長らくの間Atg8の結合基質は、PEのみとみなされていた。
申請者はこれまでに、選択的ミトコンドリア分解が誘導された酵母細胞のタンパク質をウェスタン解析してきた。その過程で、Atg8（14kDa）の抗体に特異的なバンドが、50-150 kDaの高分子量領域に複数出現することを偶然見出した。本研究では、Atg8の新規結合様式とその分子機構・生物学的意義を明らかにするため、まずはこれらの高分子量領域に現れるタンパク質群の精製を試みた。方法としてHis-FLAG-Atg8発現細胞をマイトファジー誘導条件下で培養した後、細胞を回収してライセートを調製した。これを2段階アフィニティー精製に供し、溶出したサンプルをSDS-PAGEで分離、銀染色してバンドを切り出し、LC-MS/MSで解析した。その結果、高分子量エリアの複数バンドに特異的にAtg8自身も含まれ、興味深いことに、切り出したバンドの分子量より小さいタンパク質にも関わらず、複数の高分子バンドにて、繰り返し、出現するタンパク質群（機能未知の膜タンパク質、ASU1 Atg8tylation Substrate 1, ASU2 Atg8tylation Substrate 2、酢酸耐性獲得に機能するといわれている膜タンパク質YRO2）を同定することができた。上記のタンパク質群にHA tagをつけて、免疫沈降実験を行ったところ、それぞれ相互作用を確認することができた。中でもASU1については、高分子量化したAtg8の方がより濃縮されており、共有結合等によって高分子量化した産物を検出しているものと予想された。現在、これらの結合様式の詳細解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Atg8の高分子量化産物を得るにあたって、His-FLAG-Atg8を発現した液胞内分解酵素欠損細胞とタグ無しの内在性のAtg8を発現させた株（ネガティブ・コントロール）からライセートを調製し、Ni-NTAアガロースと混合後、FLAG抗体ビーズとインキュベーション、還元状態にて溶出した。その後、SDS-PAGEで分離、銀染色を経て、高分子量域のバンドを切り出し、LC-MS/MSによる解析を繰り返した。その結果、Atg8に加え、この過程で特異的に検出されてくる、ゲルのバンドの分子量より小さいタンパク質群が得られ、機能解析へと進んだ。質量分析で得られたAtg8結合候補タンパク質にHAタグを付加し、液胞内分解酵素欠損細胞で発現させたところ、機能未知の膜タンパク質群はどれも、ウェスタンブロットにて複数のバンドで検出され、修飾を受けているタンパク質であることが推測された。
HA tag付けしたASU1 Atg8tylation Substrate 1においてはマイトファジー条件下で培養した細胞からライセートを調製し、HA抗体を用いた免疫沈降を行った際、Atg8抗体が陽性であり、Atg8の共沈よりもむしろ高分子量エリアに特異的にバンドが検出された。これはAtg8化した基質を示唆している。よって、当初予定された質量分析の解析から結果が得て、Atg8陽性タンパク質側からのAtg8結合の解析へと順調に検証を進めていると言える。現在はこれらの基質の変異体（領域欠失変異体、点変異体）を用いて、Atg8化に必要な領域・結合様式の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
①ASU1とAtg8の結合様式の解析：免疫共沈降によって、HA-ASU1とAtg8の相互作用（共有結合）は確認できているので、Atg8化部位を同定するために点変異や領域欠失変異体を用いて、免疫沈降を行い実際にASU1とAtg8の結合にどの領域が必要か、どの部位で結合しているのかを調べる。タグ付きのAtg8側から、HA-ASU1の免疫沈降も陽性が確認できており、Atg8の変異体を使った解析も同時に行う。
②Atg8化抑制、Atg8欠損による生理学的な表現型の検討：オートファジーとは別の経路で、Atg8化の役割があるとすれば、それが抑制させたことによる生理学的な影響を調べる。マイトファジーやミトコンドリアの形態・エネルギー代謝に及ぼす影響、ストレス下での耐性などを調べるアッセイを行う。
③新規Atg8結合反応に必要な遺伝子の同定：酵母の非必須遺伝子欠損ライブラリー約5,150株（市販品）でマイトファジーを誘導し、調製したライセートをウェスタン解析して、高分子量Atg8陽性タンパク質が見られない変異体を単離する。この網羅的解析には、96ウェルプレートを使用した細胞培養とそれからのタンパク質サンプルの調製が必要であり、条件・実験操作等をあらかじめ入念に検討・最適化する。同定した遺伝子について、研究室の野生株および液胞内分解酵素欠損株を用いて遺伝子破壊を行う。得られた欠損細胞でAtg8結合の異常を確認するとともに、マイトファジーやミトコンドリアの形態・エネルギー代謝が正常であるかどうかも調べる。
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| Causes of Carryover |
学会旅費等、物品の一部は学術振興会RPD研究員の研究費によって、賄われたことによって経費を節減できた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度もいくつかの学会参加、出張が計画されている。
またプロジェクトの新しい実験のアッセイ系では試薬消費などが増えてくることが見込まれる。
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Research Products
(3 results)
