2016 Fiscal Year Annual Research Report
Novel conjugation of the ubiquitin-like protein Atg8 and its biological significance
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26440052
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡本 徳子 大阪大学, 生命機能研究科, 特任講師(常勤) (90568750)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 出芽酵母 / 膜ダイナミクス / オートファジー / ユビキチン様タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Atg8はリン脂質フォスファチジルエタノールアミン（PE）に共有結合する、オートファジーに必須なユビキチン様タンパク質である。これまでの研究により、選択的ミトコンドリア分解が誘導される条件下で、Atg8抗体に陽性を示す50-150 kDaの高分子量バンドを見出した。また、これらのシグナルは、タンパク質分子間での共有結合により生じたことが示唆された。そこで、アフィニティー精製・質量分析により、Atg8と共有結合している分子を探索したところ、候補タンパク質Asu1 (Atg8ylation substrate 1)が同定された。さらに、Asu1の免疫共沈降アッセイにより、Asu1-Atg8の共有結合分子の存在を明らかにできた。
本年度においては、Asu1のAtg8化部位の同定を目指した。まず、Atg8化を質量分析するための変異体を作成した。Asu1-Atg8を質量分析によって解析する際、トリプシン処理によって生じるAtg8のC末領域のペプチドは長すぎる。そこで、C末端から4番目のN113をアルギニン置換したN113R変異体を作成した。アフィニティー精製用のHis-FLAG-Atg8(N113R)変異体のオートファジー活性を調べたところ、野生型Atg8と同様にオートファジーを駆動すること、PE化も正常に起こることを確認した。加えて、Asu1への共有結合活性を確認したところ、Asu1-Atg8(N113R)を検出することができた。
次に、上記のAtg8変異体を用いたアフィニティー精製・質量分析によるAsu1のAtg8化部位の同定を試みた。質量分析の結果、Asu1-Atg8(N113R)の分子数が質量分析に必要な量に満たなかったため、Atg8化部位を同定することができなかった。この問題を解決するため、タンパク質の過剰発現系の確立が必要であると考えられる。
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Research Products
(1 results)
