2016 Fiscal Year Research-status Report
The analysis of the molecular mechanism of amphibian metamorphosis using genomic editing
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26440057
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
矢尾板 芳郎 広島大学, 両生類研究センター, 教授 (00166472)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田澤 一朗 広島大学, 両生類研究センター, 助教 (10304388)
中島 圭介 広島大学, 両生類研究センター, 助教 (60260311)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 両生類 / 変態 / ゲノム編集 / 甲状腺ホルモン / 甲状腺ホルモン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、一連の変態関連遺伝子を標的としたTALENによる標的遺伝子破壊を行ったネッタイツメガエルの表現型の解析により変態関連遺伝子の機能を明らかにすることである。
変態関連遺伝子として、甲状腺ホルモン受容体α (TRα)、甲状腺ホルモン受容体β (TRβ)、甲状腺ホルモン活性化酵素 (D2)、甲状腺ホルモン不活性化酵素 (D3)、細胞外基質分解酵素であるstromelysin3 (STL3)とMMP9TH、細胞死関連遺伝子、T細胞の分化に必要な遺伝子であるFoxn1、尾の退縮時に幼生抗原として働くと考えられているouro1とouro2を選び、標的遺伝子破壊を行った。
ouro1やouro2のF1KOでは、標的となっているOuroタンパク質が検出限界以下になっているだけでなく、ヘテロダイマーを形成する相手側のOuroタンパク質もほとんど検出できない程度まで減少していた。それにも関わらず、これらのF1KO幼生では、尾は正常に退縮しており、尾が変態後に残ることも無かった。また、Foxn1のF1KOでは胸腺が形成されておらず、CD8陽性T細胞も脾臓から消えており、皮膚移植片拒絶反応も低下していたにも関わらず、F1KO幼生の尾も正常に縮んでおり、尾が残存することもなかった。これらの知見はOuroタンパク質がツメガエル幼生の変態期における尾の退縮に必要ないことを証明しており、従来の尾の退縮の免疫学的拒絶反応説が間違えていることが明確に示された。
TRαF1KOでは、野生型と比較して後肢の発生が初期において促進していた。これは甲状腺ホルモンが低レベルの時にはTRαが後肢の発生を抑制していることを示している。TRβF1KOでは、尾の退縮が野生型やTRαF1KOと比べて、著しく遅れていた。尾の退縮時に発現量が上昇するTRβが、幼生の尾の退縮に大きい役割を果たしていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
変態関連遺伝子として、甲状腺ホルモン受容体α (TRα)、甲状腺ホルモン受容体β (TRβ)、甲状腺ホルモン活性化酵素 (D2)、甲状腺ホルモン不活性化酵素 (D3)、細胞外基質分解酵素であるstromelysin3 (STL3)とMMP9TH、細胞死関連遺伝子、T細胞の分化に必要な遺伝子であるFoxn1、尾の退縮時に幼生抗原として働くと考えられているouro1とouro2を選び、標的遺伝子破壊を行った。F0の交配により、各標的遺伝子が両染色体上で破壊されたF1（TRα、TRβ、D3、MMP9TH、Foxn1、ouro1、ouro2）が、得られた。しかし、両生類幼生の成長が予想以上に遅れたため、解析が遅れてしまった。半年以上も発生段階が止まることがあり、人為的に早めるわけにもいかず、自然の成長に委ねるしかなく、対応に苦慮した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、甲状腺ホルモン受容体遺伝子が破壊されたF1KOの論文を執筆中である。また、「両生類の変態と哺乳類の出生の比較」に関しては、RNA seqでデータを解析中であり、変態前後の遺伝子発現への甲状腺ホルモン受容体遺伝子破壊の影響をを調べて論文をまとめる予定である。
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| Causes of Carryover |
本研究の目的は、一連の変態関連遺伝子を標的とした遺伝子編集により核遺伝子の機能を調べると共に、哺乳類の出生が両生類の変態に対応するかを明らかにすることである。当初の計画が遅れたが、効率的に進めたため、研究費を節約できた。変態の前後でRNAseqを行うことにより、研究成果をより精緻な、価値の高いものとすることができる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
変態の前後でのRNAseqを2017年になってから発注したために、年度を越す可能性が多少なり有り、そのために延長願いを提出した。しかし、年度内に支払いが済んだ。残高は32,743円であるので4月中に当該研究目的に沿って成果を上げるためにRNA精製キットとRNA primerを購入して使い切る予定である。
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