2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞質・核ＲＮＡ品質管理におけるエキソソーム複合体の共通した作用機序
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26440059
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
細田 直 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 講師 (40438198)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | RNA品質管理 / エキソソーム複合体 / エキソヌクレアーゼ / 翻訳 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等生物では多様かつ膨大なRNA分子種が細胞内に発現している。高次の生命活動においてこれらを適切に作動させるためには、異常もしくは不要RNAを分解することが必須となる。このRNA品質管理の最終ステップにおいて、3’→5’方向エキソヌクレアーゼ（エキソソーム）複合体がRNAを分解すると考えられているが、不明な点が多く残されている。本研究は、哺乳動物細胞においてエキソソーム複合体が異常RNAを識別し分解する作用機序を解明することを目的としている。
本年度は、外因性異常RNAの識別および分解機構について解析をすすめた。翻訳依存的に起動するmRNA品質管理機構（NGDやNSDなど）は、翻訳終結因子類似Dom34-Hbs1複合体が機能することが、申請者を含め複数のグループから報告されている。外因性異常RNAも翻訳依存的に分解することを申請者は見出しており、まずDom34-Hbs1複合体この分解に機能するかどうか検証した。siRNAによりDom34もしくはHbs1をノックダウンしたHeLa細胞にin vitro合成mRNAを導入し、その分解過程について検証した。Dom34ノックダウンでは顕著な分解抑制が認められるものの、意外なことにHbs1ノックダウンではほとんど認められなかった。翻訳終結因子eRF3類似タンパク質はHbs1に加えてGTPBP1/2も知られている。GTPBP1/2ノックダウンでは顕著な分解抑制が認められた。さらに、免疫沈降法によりGTPBP1/2はDom34およびエキソソーム複合体と相互作用することを見出した。以上の結果から、細胞内から外因性異常RNAを排除する機構は、Dom34-GTPBP1/2複合体を介した新しい品質管理機構であると想定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、細胞内から外因性異常RNAを排除する機構は、Dom34-GTPBP1/2複合体を介した新しい品質管理機構であると位置づけることができた。しかしながら、ノンストップmRNAなど 3’末端に露出する短鎖ポリAを引き金とする品質管理機構については、解析がやや遅れている。以上の理由により、本年度における達成度は「概ね順調にして進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）外因性異常RNAを排除する分子機構
外因性異常RNAが翻訳のどのステップで異常と識別され分解されるか明らかにする。（方法１）翻訳開始段階、伸長段階、終結段階に異常をもつin vitro合成mRNAを作製し、これらをHeLa細胞に導入し、分解過程について検証する。（方法２）ショ糖密度勾配遠心により、mRNAの翻訳の場であるポリリボソームを分画する。Dom34、GTPBP1/2、エキソソーム複合体がどのような状態のmRNAと相互作用しているか解明する。siRNAによりDom34もしくはGTPBP1/2をノックダウンし、導入したmRNAの翻訳状態について検証する。（方法３）Dom34、GTPBP1/2およびエキソソーム複合体の精製タンパク質を作製し、複合体形成様式の詳細を解明する。
（２）細胞質異常mRNAの3’末端に現れる短鎖ポリA
異常細胞質mRNA典型として、ノンストップmRNAについて解析を行う。ノンストップmRNAの分解がエキソソーム複合体により開始するとき、リボソームはポリA鎖上のどこに位置し、何塩基の短鎖ポリAが3’末端に露出するのか明らかにする。（方法１） 哺乳動物培養細胞におけるノンストップmRNAのポリA鎖長を測定する。グロビンレポータ遺伝子を培養細胞に導入しmRNAのポリA鎖短縮化を経時的に解析する実験系を用いる。（方法２） ノンストップmRNAから産生される翻訳産物の分子量を解析することにより、ポリA鎖上リボソーム停止位置を同定する。（方法３） Ski複合体、Dom34-Hbs1複合体が結合しているノンストップmRNAを、これら因子に対する特異的抗体を用いた免疫沈降法により単離し、そのポリA鎖長を測定する。
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Research Products
(10 results)
