2015 Fiscal Year Research-status Report
血清アミロイドA3の分子機構と新規細胞内情報伝達タンパク質mTOC
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26440063
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
富田 毅 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (20302242)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | セラストラマイシン / 血清アミロイド / 炎症性サイトカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血清アミロイドA3(SAA3)の分子構造研究では、溶液中の分子構造を明らかにするための研究を進めた。SAA3の溶液中での会合状態を明らかにするために、蛍光標識した精製SAA3の蛍光相関分光を行うことを計画した。SAA3に蛍光標識を導入するためにSAA3のN末端にシステインを導入した変異体を作成し、マレイミド基を持つ蛍光分子とカップリングさせることによりSAA3を蛍光標識させることができることを確認した。さらに、システインを含む6アミノ酸を追加したタグをN末端に結合させたSAA3も作成した。これらの精製タンパク質を用いて分光実験を行う予定である。mTOCの機能解析では、mTOCと相互作用するタンパク質の同定を行うことを、初めに行っている。HaloタグをN末端に結合させたmTOCを293T細胞で過剰発現させ、核抽出から部分精製を行った標品を調製した。この部分精製mTOCをHaloリガンドを固定した磁気ビーズと混合し、磁気ビーズ上に共有結合させたのち、TEVプロテアーゼにより、HaloタグからmTOCを切り離した。このTEVプロテアーゼ遊離画分を電気泳動で展開し、得られたバンドを質量分析にかけることにより、タンパク質の配列決定を行った。これと並行して、HeLa細胞核抽出液をmTOCの特異的抗体を用いて共免疫沈降を行い、得られた特異的バンドの質量分析から、結合タンパク質を同定することも行った。得られた結果からmTOC結合タンパク質の候補分子が得られたので、これらのタンパク質の抗体を用いて、改めてmTOCの免疫沈降後のウェスタンブロットを行い、質量分析の結果の再現性の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SAA3の分子構造研究では、大腸菌での発現系からの精製タンパク質調製法を見直すことにより、精製タンパク質を得る効率を上げることができた。さらに蛍光標識を導入することができることも確認できている。mTOC結合タンパク質の解析では、実験を繰り返すことにより、再現性を確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
SAA3については、実際の蛍光相関測定を行い、溶液中の構造情報を得るつもりである。mTOCについては、mTOC結合タンパク質にmTOCが結合することにより、どのような影響を与えているかについて、個別の機能アッセイを行うことにより、明らかにするつもりである。またmTOC結合タンパク質をmTOCとの相互作用が行われるドメインの解析も並行して行うつもりである。結果が得られた際には、できるだけ早急に学術論文にまとめ、発表するつもりである。
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| Causes of Carryover |
mTOC結合タンパク質の候補タンパク質クローニングのためのプライマーおよびその配列確認のためのプライマーおよび試薬を購入する予定であったが、クローニングに予想以上に時間がかかってしまい、試薬の発注が遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
クローニングにかかわる消耗品に使用する予定である。
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