2015 Fiscal Year Research-status Report
シグナル伝達における酸性オルガネラの生理機能及びその分子機構の解析
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26440068
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
和田 戈虹 (孫戈虹) 同志社女子大学, 薬学部, 教授 (00314427)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | V-ATPase / mTOR / リソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mVam2やRab7をノックアウトしたマウスは胎生致死である。イントロン内にloxPを導入したホモ接合体は野生型と同様明らかな表現型を示さない。今年度、Cre recombinaseを発現するadenovirus (AdxCre)を用い、mVam2やRab7を欠損させたMEF細胞を樹立し、mVam2欠損MEF細胞では、リソソームのマーカー・タンパク質であるLamp2に対する抗体を用いて蛍光染色を行ったところ、mVam2欠損MEF細胞では、リソソームがLamp2のシグナルが野生型に比べて著しく低下し、リソソームの形態形成が異常であることを明らかにした。Rab7欠損MEF細胞も同様な手法を用いて樹立し、Rab7欠損MEF細胞では、Lamp2のシグナルが野生型に比べて上昇することが明らかとなった。また、リソソーム形態形成に必要なHOPSタンパク質mVam5,8,9のタンパク質の量が変異細胞で蓄積していることが示された。さらに変異細胞では、、細胞内のLC3やp62などのオートファジーのマーカーが蓄積していることが明らかとなった。
これらの変異細胞を用いて、mTORC1の活性化がどのように変化するか、mTORの基質であるS6 kinase (T389), 4EBPのリン酸化状態を調べたところと、野生型に比べて、飢餓条件に対する応答が著しく低下したことが示された。今後、mTOR シグナルが増殖因子の経路由来か、それとも栄養供給を感知する経路由来かを明らかにしていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定している酸性オルガネラの形態形成異常の細胞の構築：mVam2やRab7欠損細胞の構築が計画通り、順調に進展し、これらの変異細胞を用いた解析が進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
mTOR シグナルは細胞増殖と分化の制御の要として知られているが、初期発生における役割はほとんど解明されておらず、mTOR の活性化がエンドソーム・リソソーム系オルガネラを必要とするという報告もあることから、リソソーム形成に重要な役割を持つHOPS複合体の構成因子の変異胚で、mTOR シグナルに異常が起きている可能性があると考える。HOPS因子の欠損マウスが形態的にmTOR欠損マウスと酷似した表現型を示すことから（未発表データ）、初期胚での栄養供給、増殖因子のシグナル伝達、mTOR 活性の状態を各胚葉ごとに解析し、初期発生における新たなシグナル伝達経路の知見が得られることも期待している。今後、細胞レベルでの解析と同時に、マウス欠損胚を用いた解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
実験の進捗度に合わせ、実験動物や動物実験用の器具等の購入は次年度に変更したためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験動物や動物実験用の器具等を購入する予定
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